HRE介导的NT-3表达上调减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤

张军峰，史利利，张 力，李红波，张建水，祁存芳，刘 勇，徐 曦*

（1.西安医学院人体解剖学教研室，陕西西安 710021;2.西安交通大学医学部神经生物学研究所，陕西西安 710061）

HRE介导的NT-3表达上调减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤

张军峰1，史利利1，张 力1，李红波1，张建水2，祁存芳2，刘 勇2，徐 曦1*

（1.西安医学院人体解剖学教研室，陕西西安 710021;2.西安交通大学医学部神经生物学研究所，陕西西安 710061）

目的 在大鼠局灶性脑缺血模型中观察低氧反应元件（HRE）介导的神经营养因子-3（NT-3）缺血/低氧调控表达及其对缺血再灌注脑损伤的保护作用。方法 将重组反转录病毒（RV-5HRE-NT3及RV-5HRE-EGFP）或0.9%氯化钠溶液（对照组）注射入大鼠脑内3 d后，用大脑中动脉线栓阻塞法（tMCAO）制作大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型。用免疫组织化学染色法和Western blot法检测NT-3的表达，用TTC染色法检测脑梗死体积，用TUNEL染色法检测细胞凋亡，用Reglodi评分法检测大鼠神经功能情况。结果 大鼠tMCAO 3 d后RV-5HRE-NT3组中NT-3阳性细胞数明显高于对照组和RV-5HRE-EGFP组，且着色较深;tMCAO后第1、3、7和14天，RV-5HRE-NT3组中的NT-3蛋白表达均明显高于对照组和RV-5HRE-EGFP组（P＜0.05）。在RV-5HRE-NT3组中，tMCAO 3 d大鼠脑梗死体积百分比明显减小（P＜0.05），tMCAO 3和7 d后缺血半暗带凋亡细胞百分比也明显减少（P＜0.05）。RV-5HRE-NT3注射可以改善大鼠tMCAO后的神经功能障碍。结论 HRE介导的NT-3低氧反应性表达上调可以减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注脑损伤。

低氧诱导基因表达;神经保护;缺血性脑卒中;基因治疗

*通信作者（corresponding author）:xmux@qq.com

缺血性脑卒中是临床上常见的严重危害人类健康的疾病之一，具有致死率和致残率高等特点［1］。神经营养因子-3（neurotrophin-3，NT-3）是一种具有多功能的神经营养因子，除了维持神经元存活、诱导神经元分化和促进神经损伤修复的神经保护作用外，其还与血管发生密切相关，是治疗缺血性脑卒中的理想选择之一［2］。采用基因表达载体将NT-3导入脑组织或脑血管中，通过其在局部的表达可以对脑组织产生神经保护作用。但是外源基因在脑内过表达可能会引起癫痫和肿瘤等不良反应，因此，构建靶向性和可控性的基因载体对解决基因治疗的安全性非常重要。

在多种组织出现低氧时，低氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor 1，HIF-1）与低氧反应元件（hypoxia responsive element，HRE）相互作用，可以诱导一系列低氧相关基因表达［3］。脑缺血后局部组织存在的低氧微环境致HIF-1α表达上调［4］，鉴于缺血性脑卒中的此特性，本研究将5个拷贝的人血管内皮生长因子来源的HRE（5HRE）与猴空泡病毒40最小启动子（simian virus 40 minimal promoter，SV40mp）连接组成低氧调控序列，与NT-3序列融合后构建成重组反转录病毒载体，在大鼠局灶性脑缺血模型中观察5HRE对目的基因NT-3表达的缺血/低氧靶向性调控作用，及5HRE-NT3转导对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的神经保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒及实验动物:反转录病毒RV-EGFP、RV-5HRE-EGFP和RV-5HRE-NT3由本实验室构建、包装、纯化和浓缩（图1）。SPF级SD大鼠，雄性，250～300 g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供（SCXK［陕］2012-003）。

1.1.2 试剂:2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC，Sigma公司）;兔抗人NT-3单克隆抗体、小鼠抗β-actin单克隆抗体、HRP标记的山羊抗兔二抗、HRP标记的山羊抗小鼠二抗（Santa Cruz公司）;ECL化学发光底物试剂盒（Pierce公司）;DeadEndTMColorimetric TUNEL System试剂盒（Promega公司）。

1.2 方法

图1 重组反转录病毒结构示意图Fig 1 Structure of the recombinant retroviral vectors

1.2.1 脑组织注射反转录病毒:适应性饲养1周后将大鼠随机分为3组:对照组（注射0.9%氯化钠溶液）、RV-5HRE-EGFP注射组、RV-5HRE-NT3注射组。参照大鼠立体定位图谱，选择两点进行注射（图2A），坐标:前囟水平，矢状缝右侧旁开2.5 mm，硬脑膜下4 mm和3 mm两点;0.9%氯化钠溶液或者病毒注射剂量 10 μL，注射速度 1 μL/min。3 d后，用大脑中动脉线栓阻塞法（tMCAO）制作局灶性脑缺血模型［5］。

图2 病毒脑内注射部位（A）及注射3 d后EGFP表达情况（B）Fig 2 Injection sites of the vectors（A）and expression of EGFP three days after injection（B）（×40）

1.2.3 免疫组织化学染色和Western blot蛋白印迹法:tMCAO 3 d后，用免疫组织化染色法检测脑内NT-3的表达，DAB显色、苏木精对核进行复染、中性树胶封片，采集图像并分析。此外，为检测反转录病毒对大鼠脑内细胞感染的有效性，在脑内注射RV-EGFP 3d后，用荧光显微镜观察大鼠脑内报告基因EGFP表达情况。tMCAO 1、3、7和14 d后，用Western blot蛋白印迹法检测脑内NT-3的表达;以注射针道为基准，分别在其吻侧和尾侧2 mm处作冠状切，从此脑片切取大脑缺血半暗带组织，RIPA裂解法抽提细胞总蛋白进行Western blot蛋白印迹，结果以目的蛋白/内参吸光度的比值来表示。

1.2.4 TTC染色及缺血体积计算:tMCAO 3 d后，用10%水合氯醛（350mg/kg，腹腔）麻醉大鼠，快速断头，分离脑组织，将其置于预冷的大鼠脑切片模具中切片，放于37℃预热的1%TTC溶液中，37℃孵育15 min;采集图片后用图像分析软件Image-Pro Plus测量每个脑片缺血梗死面积和双侧半球的面积，结合脑切片间距离计算脑缺血梗死体积。水肿指数用缺血对侧半球的体积除以同侧半球的体积来表示，实际梗死体积用测量的梗死体积除以水肿指数［6］。

1.2.5 神经行为学评定方法:参照Reglodi等［7］的大脑中动脉阻塞大鼠神经功能测试评分方法，在tMCAO 前1 d，tMCAO 后1、3、5、7、14 和28 d 对各组大鼠进行神经功能评分。

1.2.6 TUNEL染色:tMCAO 3和7 d后，用TUNEL试剂盒检测细胞凋亡。按照说明书完成标记后，用苏木精将核复染;采集图片后用Image-Pro plus图像分析软件进行图像分析，每个样本取3张尾壳核脑片进行细胞计数，每张脑片在40倍物镜下取3个视野对总细胞和TUNEL阳性细胞进行计数，计数结果以TUNEL阳性细胞数/细胞数×100%表示。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 重组反转录病毒局部注射后外源基因在大鼠脑内的表达

注射重组反转录病毒RV-EGFP 3 d后，在注射部位及其附近均有EGFP表达（图2B），在对照组和正常组未见EGFP表达。

2.2 tMCAO后5HRE上调缺血的脑组织中NT-3的表达

tMCAO 3 d后，在RV-5HRE-NT3组，NT-3阳性细胞数明显比对照组和RV-5HRE-EGFP组多，且着色较深（图3）。在tMCAO 1 d时，RV-5HRE-NT3组中的NT-3蛋白表达明显高于对照组和RV-5HREEGFP组（P＜0.05）（图4）。在 tMCAO后第 3、7和14天，各组中NT-3的蛋白表达情况同第1天。

2.3 RV-5HRE-NT3减小大鼠tMCAO后脑梗死体积

tMCAO 3 d后，大鼠脑片TTC染色在正常脑组织被染成红色，而缺血梗死区不能着色，仍为白色（图5A）。与对照组和 RV-5HRE-EGFP组相比，RV-5HRE-NT3治疗组的梗死体积明显减小（P＜0.05）（图5B）。

2.4 RV-5HRE-NT3减轻大鼠tMCAO后神经功能损伤

与正常组相比（tMCAO前1 d），tMCAO后Reglodi评分明显升高，且一直持续到tMCAO后第14天;从 tMCAO后第1～14天，RV-5HRE-NT3组的Reglodi评分明显低于对照组和RV-5HRE-EGFP组（P＜0.05）（图6）。

图3 免疫组织化学检测tMCAO后大鼠脑组织中NT-3的表达Fig 3 Expression of NT-3 after injection in the ischemic rat brain（×400）

图4 Western blot检测tMCAO后大鼠脑组织中NT-3的表达Fig 4 Increased NT-3 expression after RV-5H-NT3 transduction in the ischemic rat brain（±s，n=3）

图5 RV-5H-NT3转导减小大鼠tMCAO后脑梗死体积Fig 5 RV-5H-NT3 transduction attenuated infarct volume of rats subjected to tMCAO（±s，n=6）

2.5 RV-5HRE-NT3减少大鼠tMCAO后细胞凋亡

在大鼠tMCAO后第7天，凋亡细胞成棕色着色，结合复染的细胞核，发现在tMCAO后第7天缺血半暗带有大量细胞凋亡，但RV-5HRE-NT3组的凋亡细胞百分比与对照组和RV-5HRE-EGFP组相比均显著降低（P＜0.05）（图7）。

图6 RV-5H-NT3转导促进大鼠tMCAO后神经功能恢复Fig 6 RV-5H-NT3 transduction improved the neurological status of rats subjected to tMCAO（±s，n=12）

3 讨论

低氧特异性基因表达调节系统已被用来于动物模型中，进行低氧相关疾病的治疗研究，如肿瘤、缺血性心肌病和脑卒中等［4，8-9］。在此系统中HIF-1α可以通过与多拷贝的HRE结合进而触发治疗基因转录，促进其表达。低氧反应性调节系统的在体研究中，HRE同样发挥着调节靶基因表达的重要作用，即在正常组织中靶基因不表达或者低表达，而在缺血/低氧组织中高表达。因此，5HRE可以作为低氧反应性表达调控的有效元件，在其介导下常氧条件下外源基因转录表达活性明显减少，进而可以减少或者消除由于外源基因过表达所引起的不良反应。低氧条件下，HRE还可以反应性上调下游基因的表达［10］，通过5HRE 的调控，tMCAO 1 d后 NT-3蛋白表达明显升高，且持续至2周。进一步说明5HRE和SV40mp组合是一种有效的调节治疗基因低氧/缺血反应性调节的表达框。

图7 RV-5H-NT3转导减少tMCAO大鼠脑组织中细胞凋亡Fig 7 RV-5H-NT3 transduction decreased apoptosisin the penumbra（×400）（±s，n=6）

反转录病毒载体将NT-3转导入大鼠脑后，无论是由新生神经元或胶质细胞，作为一种分泌蛋白，NT-3都可以被释放到胞外，并扩散和作用于周围组织。所以局部表达的NT-3可以对与其毗邻的很大范围内的缺血/低氧脑组织产生神经保护作用，包括减小大鼠脑缺血损伤的梗死体积百分比、明显减轻大鼠的神经功能损伤。

本研究证实了在大鼠脑内5HRE可以缺血/低氧反应性上调NT-3的表达。缺血/低氧反应性高表达的NT-3可以减小缺血性脑损伤引起的脑梗死体积和细胞凋亡，同时tMCAO后神经功能损伤明显减轻。提示HRE介导的低氧反应性调控系统可以为神经系统缺血/低氧性紊乱和其他缺血/低氧相关疾病的基因治疗提供有效的治疗方法。

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Up-regulated expression of NT-3 attenuates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats

ZHANG Jun-feng1，SHI Li-li1，ZHANG Li1，LI Hong-bo1，ZHANG Jian-shui2，QI Cun-fang2，LIU Yong2，XU Xi1*

（1.Dept.of Anatomy，Xi'an Medical University，Xi'an 710021;2.Institute of Neurobiology，Xi'an Jiaotong University Health Science Center，Xi'an 710061，China）

ObjectiveTo investigate the neuroprotective effects of neurotrophin-3（NT-3）expression controlled by five copies of the hypoxia-responsive elements after focal cerebral ischemia.MethodsThree groups of rats

RV-5H-NT3，RV-5H-EGFP or saline injection.Three days after gene transfer，the rats underwent 90 min of transient middle cerebral artery occlusion（tMCAO），followed by 1－28 days of reperfusion.Immunohistostaining and western blotting were performed to detect ischemia/hypoxia-regulated expression of NT-3 controlled by HRE.The volume of brain infarction and the apoptosis were analysised by TTC and TUNEL staining.The neurological scoring was determined by neurological behavior tests.ResultsThree days after tMCAO，brain NT-3 expression was significantly increased in the RV-5HNT3-transduced animals compared with the RV-5H-EGFP or saline group（P＜0.05），and brain infarct volume was smaller in the RV-5H-NT3-transduced group than the RV-5H-EGFP or saline group（P＜0.05）.The percentage of TUNEL-positive cells was reduced in RV-5H-NT3-transduced brains compared with the RV-5HEGFP or saline group 3 and 7 days after tMCAO（P＜0.05）.Furthermore，the neurological status of RV-5H-NT3-transduced rats was better than that of RV-5H-EGFP-or saline-transduced animals from 1 day to 4 weeks after tMCAO（P＜0.05）.ConclusionsHRE may modulate NT-3 expression in the ischemic brain tissue and that the up-regulated NT-3 may effectively improve neurological status following tMCAO due to decreased initial damage.

hypoxia-inducible gene expression;neuroprotection;ischemic stroke;gene therapy

R338;R741.02

A

10.16352/j.issn.1001-6325.2015.09.010

1001-6325（2015）09-1199-06

2015-03-27

2015-05-26

国家自然科学基金（81301041）;陕西省教育厅专项科研计划（2013JK0756、14JK1613、14JK1614）;陕西省青年科技新星项目（2015KJXX-43）;西安医学院博士基金（2012DOC02）;陕西省优势学科建设经费（陕教位［2014］3号-1001）