抗禽流感病毒药物的现状及研究趋势

董丽花

(泰山医学院化学与化工学院，山东泰安271016)

抗禽流感病毒药物的现状及研究趋势

董丽花

(泰山医学院化学与化工学院，山东泰安271016)

禽流感病毒;药物;研究趋势

禽流感是由甲型流感病毒中的一种亚型(也称禽流感病毒)引起的一种急性传染病，通常只感染鸟类，在特定情况下，也可以感染人。人感染禽流感病毒后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肺等多种脏器衰竭导致死亡，病死率高达33%。此病可以通过消化道、呼吸道、皮肤损伤和眼结膜等多种途径传播，危害性非常强。自从1997年在香港发现首例人类感染禽流感后，此病引起全世界卫生组织的高度关注。后来，本病一直在亚洲地区零星爆发，2003年，高致病性H5N1禽流感病毒从东南亚国家开始蔓延，不断引起人群感染和死亡，并构成越来越严峻的大规模流行;目前该病毒已经扩大到全世界许多国家，受此威胁的人群数量不但增加。2012年3月，台湾首度发生H5N2高致病性禽流感，引起人们的高度重视;2013年3月以来，我国多个省份和地区陆续发现H7N9禽流感病毒感染人的情况，加剧了人们对禽流感病毒的恐惧。

当前对于禽流感病毒的主要防治措施是接种疫苗，但疫苗接种率相对较低，很难产生有效的群体免疫;对于高危人群很难产生有效的免疫力;并且由于禽流感病毒毒株的高度复杂性，疫苗研发的速度远远落后于病毒变异的速度。

1 禽流感病毒的结构及致病机制

禽流感病毒属于A型流感病毒，其结构与一般流感病毒相似，病毒形态呈球状或丝状，球形直径为80～120nm。病毒结构自外而内可分为包膜、基质蛋白及核心三部分。病毒的核心包含了存储病毒信息的遗传物质以及复制这些信息必须的酶，病毒的核衣壳呈球形对称。自核衣而外，依次包含有8个片段的单链核糖核酸，以及核蛋白、基质蛋白、脂质双层、血凝素和神经氨酸酶等组分。其中基质蛋白和来自宿主细胞的脂质双层组成了病毒的包膜，膜上覆盖有两种表面糖蛋白:一是植物血凝素(即H)，另一种为神经氨酸酶(即N)。H又分为15个亚型，N分为9个亚型［1］。并非所有的禽流感病毒都可以引起人类流感，目前已知的禽流感病毒中，H5、H7和H9可以传染给人，其中H5为高致病性病毒。

人感染禽流感后，禽流感病毒首先附着在人体宿主细胞上，病毒表面的血凝素H介导病毒粒子与宿主细胞表面糖蛋白受体唾液寡聚糖结合;通过受体介导的内吞作用，禽流感病毒进入宿主细胞，并在宿主细胞中复制基因和病毒蛋白质;禽流感病毒表面的神经氨酸酶N可促使新形成的病毒粒子从宿主细胞中释放出来，再感染新的宿主细胞，使得禽流感病毒不断传播［2］。

根据禽流感病毒的致病机制，寻找合适的靶点，切断病毒在宿主中的生存和代谢途径，是防治禽流感病毒的有效措施。目前广泛使用的抗禽流感病毒药物主要有M2离子通道阻滞剂和神经氨酸酶抑制剂。

2 M2离子通道阻滞剂

M2蛋白在禽流感病毒和人类流感病毒毒株间具有高度保守型，为四聚体跨膜蛋白，构成跨膜螺旋的四聚体形成质子通道，具有低pH激活的离子通道活性，使病毒通过内体进入细胞浆。M2离子通道阻滞剂通过与M2蛋白结合，可以阻断M2质子通道，使病毒不能在宿主细胞中释放出衣壳中的遗传物质，因此病毒不能在细胞中复制，也不能转录翻译病毒蛋白。

目前临床上广泛使用的M2蛋白通道阻滞剂有两种，即金刚烷胺和金刚乙胺［3，4］(如图1a，1b)。金刚烷胺是美国批准的第一个抗病毒化学药物，金刚乙胺是其乙基类似物。二者主要对甲型流感病毒有较好的抑制剂作用，半数抑制剂浓度(IC50)分别为0.1～0.4、0.01～0.1?g/ml。实验表明，金刚烷胺及其衍生物能有效抑制禽流感病毒H7N7的复制［4］。但2004年WHO研究发现，在亚洲流行的禽流感病毒株H5N1对金刚烷胺和金刚乙胺都不敏感。另外，口服金刚烷胺或金刚乙胺治疗禽流感可以在1～2日内减轻症状，缓解全身性或呼吸道症状，但2－3日后出现耐药，5－7日后出现耐药株，并且可能出现交叉耐药现象［6］。国外报道金刚烷胺的耐药性可达33%以上［7］。另外，离子通道阻滞剂治疗流感能够产生许多副反应，如肌痛、头晕、呕吐等，主要表现为肝损伤。由于不良反应和出现了耐药毒株的传播，限制了此该类药物在临床上的应用。

图1 几种常见抗流感病毒药物的分子结构

3 神经氨酸酶抑制剂

神经氨酸酶(NA)在禽流感病毒复制和感染过程中起着重要的作用，它能催化裂解宿主细胞表面受体末端的唾液酸残基与糖蛋白、糖脂和寡聚糖之间的α－糖苷键，从而促进新形成的病毒粒子从宿主细胞表面释放，进而从感染的呼吸道黏膜向周围组织扩散。NA抑制剂可选择性地抑制剂NA的活性，阻止子代的病毒粒子在宿主细胞表面的复制和释放，从而有效地预防和缓解禽流感症状。

对NA抑制剂的研究始于1969年，当时合成的第一个药物是2－脱氧－2，3脱氢－N－乙酰神经氨酸，但由于其活性和特异性低而无法应用于临床。随着神经氨酸酶及其与底物复合物的晶体结构被陆续报道，NA抑制剂的研究进展迅速。

扎那米韦1993年合成了NA抑制剂扎那米韦，其结构如图1c所示，实验表明，扎那米韦能特异性地抑制甲型禽流感病毒;另外他还对H5N1感染的小鼠有保护作用［8］。临床研究表明，扎那米韦能显著减少流感主要症状持续的平均时间，并且可以减少解热镇痛药的用量［9］。但是，该药口服利用率低(2%)，近年来，扎那米韦衍生物引起人们的关注，实验表明，扎那米韦衍生物的体外活性增强，小鼠的口服利用率有所提高［10－11］。

磷酸奥司他韦作为罗氏公司开发的第二个有效的NA抑制剂，磷酸奥司他韦(图1d)对甲型和乙型流感病毒均有抑制作用。磷酸奥司他韦口服后经肝脏和肠道酯酶迅速催化转化为其活性代谢物奥司他韦羧酸，奥司他韦羧酸的构型与神经氨酸的过渡态相似，能够竞争性地与流感病毒神经氨酸酶(NA)的活动位点结合，因而是一种强效的高选择性的神经氨酸酶抑制剂。该药在多种动物体内有很高的生物利用度，人类口服利用率为80%。临床研究表明，奥司他韦可以有效地治疗禽流感，明显减少病程、缩短发热时间、降低并发症的发生［12］。

帕拉米韦帕拉米韦是一种新颖的环戊烷类抗流感病毒药物NA抑制剂，该药物可以抑制所有已知的N病毒亚型，对H5N1的体外活性实验表明，帕拉米韦的药物活性不低于扎那米韦［13］。由于帕拉米韦与神经氨酸酶活性位点的结合半衰期长，可以减少给药次数。但是口服帕拉米韦的生物利用率低，目前对该药的研究主要集中在肠胃外给药方面。2013年4月5日，国家食品药品监督管理总局批准了抗流感新药帕拉米韦氯化钠注射液，现有临床试验数据证明其对甲型和乙型流感有效，目前国内发现的H7N9禽流感病毒属于甲型流感病毒。

神经氨酸酶抑制剂在禽流感的预防和治疗过程中发挥了重要的作用。由于扎那米韦的口服利用率低，目前，奥司他韦被许多国家列为预防禽流感大规模流行的储备用药。然而，近年来，研究人员陆续发现了对奥司他韦产生抗性的H1N1、H5N1、H3N2和B型耐药株［14］，将抗禽流感病毒药物的研发提上了新的日程，开发新的抗病毒靶标迫在眉睫。

4 新型抗禽流感病毒药物的研究方向

4．1NS1蛋白抑制剂

2006年，美国孟菲斯圣犹大儿童医院的研究人员研究发现，在H5N1禽流感病毒感染人类的过程中，一种名叫NS1的蛋白起了重要作用［15］。H5N1型禽流感病毒的NS1蛋白质有一段特征序列，能使这种蛋白质与多个细胞内受体结合，破坏细胞内的关键信号传导通道，使宿主细胞死亡。这可能是H5N1型禽流感病毒高致死率的关键所在，而普通的人类流感病毒则没有这段特征序列。如果能阻断NS1蛋白和细胞内受体结合，就可以大幅度降低H5N1型禽流感病毒的致死率。2008年，得到了H5N1型禽流感病毒NS1蛋白的晶体结构［16］。NS1蛋白根据其功能被定义为两个区域:RNA结合域和效应区。RNA结合域在靠近dsRNA结合面有一个口袋，这个口袋已经被证明可以作为抗病毒药物设计的靶点。2008年，Maroto等［17］以这个结合口袋为靶点建立了一种高通量筛选方法用于寻找抗病毒药物，并成功筛选出3个有活性的抑制剂。随后，Basu等［18］也通过一种基于酵母的实验成功筛选出四个具有生物活性的NS1蛋白抑制剂。这些抑制剂与NS1蛋白的作用机制及药理作用成为抗禽流感病毒药物研究的新课题。

4．2RNA聚合酶抑制剂

禽流感病毒是含有8个RNA基因组片段负链RNA病毒，已知可以编码11种病毒蛋白质，其中，PB1，PB2和PA等三个蛋白质亚基组成流感病毒的重要生命机器——流感病毒RNA聚合酶，该酶在所有的流感病毒菌株中具有高度保守性，但是在哺乳动物中却没有同源蛋白，被视为流感病毒重要的“心脏”。在流感病毒的复制和传染过程中，流感病毒聚合酶发挥了至关重要的作用，它行驶病毒RNA的复制及mRNA的转录等多方面的功能。2009年中科院的刘迎芳和南开大学的饶子和教授系统解析了禽流感病毒H5N1毒株RNA聚合酶复合体PA亚基氨基端的基本结构;同时，Alexandre Dias等人也得到了包含209个残基的PA亚基氨基端的晶体结构，以上两篇文章发表在2009年同一期的《nature》杂志上［19－20］。结构分析表明该蛋白是一个具有新型结构的核酸内切酶，该内切酶活性将使聚合酶复合体捕获的宿主细胞mRNA，作为病毒转录酶进行转录的引物。抑制该酶的活性，可以阻断流感病毒在细胞内转录mRNA，从而使流感病毒在体内丧失活性。因此RNA聚合酶成为抗流感病毒药物研究和开发的新靶标，根据RNA聚合酶酶的晶体结构，设计和开发相应的核酸内切酶抑制剂，成为抗流感药物研究的一个新方向［21－22］。

至今发现并合成的流感病毒核酸内切酶抑制剂主要有三大类，2，4－二酮丁酸是发现最早的一类核酸内切酶抑制剂(图2a)，代表物如L－742，001［23］，实验表明L－742，001对流感病毒PA mRNA、PA vRNA的合成有抑制作用，还能有效阻止药物被移除后流感病毒的再生。第二类抑制剂为氟他胺类化合物［24－25］(图2b)，这是一类真菌代谢物，对核酸内切酶具有高度选择性。另一类核酸内切酶抑制剂为N－羟基亚胺类，虽然它对核酸内切酶具有高度的抑制活性，但是由于此类抑制剂的类似物很少，对其结构活性关系研究鲜有报道。尽管各类抑制剂的结构不同，但都能以相似的方式结合到禽流感RNA聚合酶PAN的活性中心而发挥其抑制作用，通过与活性位点的Mn2+及周围残基的相互作用阻断病毒病毒mRNA的转录(图3)。

图2 核酸内切酶抑制剂的分子结构

图3 三种抑制剂与RNA聚合酶PAN活性中心Mn2+的结合模式

目前，对禽流感RNA聚合酶抑制剂的研究大多停留在实验研究方面，并且流感病毒菌株的快速变异性导致抗病毒药物的活性测定十分困难，药物的研发是一个复杂严谨，周期漫长的过程，至今还没有针对这一聚合酶的新药物问世。

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R917

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:7115-1004(2015)06-0707-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2015.06.045

2015－1－8)

山东省高等学校科研计划项目(批准号:J12LD10)。

董丽花，女，博士，主要从事药物与蛋白相互作用的研究，E－mail address:donglihua1976@163.com。