通心络胶囊对心肌缺血大鼠血管新生功能的影响

张冰睿

(山东中医药大学基础医学院，山东济南250014)

通心络胶囊对心肌缺血大鼠血管新生功能的影响

张冰睿

(山东中医药大学基础医学院，山东济南250014)

目的观察通心络胶囊对心肌缺血大鼠血管新生功能的影响并探讨其作用机制。方法60只SD大鼠随机分为正常组、模型组、通心络低剂量组、通心络高剂量组、bFGF阳性药对照组，结扎冠状动脉左前降支制作大鼠心肌缺血模型，组织植块法培养心肌微血管内皮细胞(CMECs)，观察在血管生成过程中通心络胶囊及各对照组含药血清对CMECs“增殖”、“迁移”和“成管”不同环节的干预作用。实时定量聚合酶链反应(real－time PCR)检测各组血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达水平。结果各药物组干预后，CMECs的增殖率、迁移率、成管率呈现出正常组＞bFGF组＞通心络高剂量组＞通心络低剂量组＞模型组的趋势，通心络高剂量组对血管生成的不同环节均有明显促进作用并显著优于其他各组(P＜0.01)，与bFGF组比较无统计学差异(P＞0.05)。通心络高剂量组CMECs中VEGF、bFGF表达上调，其中VEGF表达水平显著高于模型组和低剂量组(P＜0.01)。结论通心络胶囊能够促进缺血CMECs“增殖”、“迁移”和“成管”，发挥自身血管搭桥的作用，其机制可能与上调VEGF、bFGF表达有关。

通心络胶囊;心肌缺血;血管新生

冠心病(Coronary Artery Heart Disease，CHD)心肌缺血和心肌梗死是临床常见病和多发病。WHO统计表明，CHD是当前最常见的死因，严重威胁人类健康。寻找心肌缺血后血运重建的方法改善心肌供血，建立侧支循环、促进血管新生是保护缺血心肌的重要策略［1］。中医学认为，气虚血瘀是心肌缺血和心肌梗死的基本病机，益气活血法己成为其主要治则。通心络胶囊是基于中医络病理论为指导研制而成的中药复方制剂，具有抗动脉粥样硬化、改善血管内皮功能等作用，临床上用于治疗冠心病取得了良好效果。其保护心肌的作用可能与促进缺血心肌血管新生有关。本实验通过大鼠心肌缺血模型，观察通心络胶囊对缺血心肌血管新生功能及血管内皮细胞生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)的影响，探讨其对冠心病心肌缺血血管生成的作用并探讨其作用机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性SD大鼠，体重210～260 g，购自山东中医药大学实验动物中心，合格证号SCXK(鲁) 2011－0003，每日给予标准鼠料、水喂养不限。

1.2 主要仪器

CO2培养箱(美国Heraeus公司)，倒置相差显微镜(德国Zeiss公司)，酶联免疫检测仪(美国BIO－TEK公司)，低温高速离心机(美国Thermo Scientific公司)，心电图机(北京福田电子医疗仪器有限公司)，荧光实时定量PCR仪7300型(美国Applied biosystems公司)，小动物呼吸机(美国BIRD制造公司)，紫外分光光度计(美国Thermo Scientific公司)。

1.3 主要试剂

噻唑蓝(MTT，北京Solarbio公司)，二甲基亚枫(DMSO，美国Amresco公司)，Trizol(美国Invirotrogen公司)，TIANScript RT KIT反转录试剂盒(北京天根生化科技公司)，SYBR Premix Ex TaqTM realtime－PCR试剂盒(大连TaKaRa公司)，引物由上海生工生物工程有限公司设计合成。

1.4 实验方法

1.4.1 心肌缺血模型制作参照Drexler等方法［2－4］，采用结扎法制作心肌缺血模型。术前12 h给动物禁食，称重，3%戊巴比妥钠0.1 ml/100 mg腹腔注射麻醉，固定记录心电图。备皮并消毒，颈部正中暴露并切开气管，待打开胸腔时连接小动物呼吸机，按潮气量1～1.5 ml/100 g，频率80～90次/ min给予呼气末持续正压呼吸，呼吸比率为2－2.5∶1，依据呼吸深度和频率进行参数调整。胸部正中左侧0.5 cm处作长约2 cm纵向切口，放置开睑器暴露心脏。在肺动脉圆锥与左心耳交界下约2 mm处用无创缝线结扎左侧冠状动脉前降支，记录心电图出现Q波、T波高耸或倒置、ST段抬高［5］，证实结扎成功。观察大鼠呼吸平稳，缝合气管，术后24 h存活即为模型制作成功。

1.4.2 分组和给药共分为5组，将造模成功的大鼠随机分为4组:模型组(M组)、通心络低剂量组(L组)、通心络高剂量组(H组)、bFGF阳性药对照组(P组)，每组12只。另外，未做手术的12只大鼠作为正常对照组(N组)。L组和H组分别用通心络胶囊0.41 g kg－1d－1、0.82 g kg－1d－1(分别按成人用量的8倍、16倍计算)加生理盐水共4 ml灌胃，每天1次［6］。P组于开胸结扎成功后，立即选择结扎处及其下部2点，行心肌内注射重组bFGF蛋白，每点用量为10 ul(10 ug)。N组和M组每天单用生理盐水灌胃1次，每次4 ml。共灌胃2周，期间各组饮水、饲料不限。2周后检测各项指标。

1.4.3 大鼠CMECs培养和鉴定组织植块法［7，8］。干预2周后选取各组大鼠，称重，3%戊巴比妥钠0.1 ml/100 mg腹腔注射麻醉，75%乙醇消毒浸泡5 min。开胸剪下心脏，置于无菌培养皿中，去除大血管、左右心房、右心室、室间隔，PBS反复冲洗，将余下的心室肌转移至小烧杯中，眼科剪剪碎约2 mm3的组织块。将组织块均匀接种于滴加1 ml胎牛血清的培养瓶中，置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱静置培养，直到细胞生长至近融合。免疫细胞化学检测Ⅷ因子蛋白表达鉴定微血管内皮细胞。

1.4.4 MTT比色法检测细胞增殖收获各组对数生长期CMECs消化重悬，制成单细胞悬液，按每孔3×104个接种于24孔培养板中。24 h后分别加入空白血清、通心络低剂量血清、通心络高剂量血清、bFGF血清继续培养3天。加入噻唑蓝溶液(5 g/L) 20 l，37℃继续孵育4 h，终止培养。吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 l DMSO，酶联免疫检测仪于490 nm波长测定吸光度，计算增殖率［9，10］。

1.4.5 划痕法检测细胞迁移当细胞生长至80%融合时，将各组细胞消化，分别加入含有空白血清、通心络低剂量血清、通心络高剂量血清、bFGF血清的DMEM培养液，接种于24孔板，用灭菌10 μl枪头在24孔板底部中间划出一个“十”字形，在5% CO2、37℃培养箱中继续培养，计算迁移率［11］。

1.4.6 管腔结构的形成倒置相差显微镜观察CMECs管腔结构的形成，计数成管情况。当细胞生长至80%融合时，将各组细胞消化分别加入含有空白血清、通心络低剂量血清、通心络高剂量血清、bFGF血清的DMEM培养液接种于6孔板，于倒置相差显微镜下(100×)观察细胞成管情况，以内皮细胞连接呈“C”形即算一个管腔。每孔取3处管腔密集的视野，在放大(100×)的视野计数管腔数。每组随机获取10个图像，取平均值，计算成管率。

1.4.7 实时定量聚合酶链反应(real－time PCR)分别取各组细胞按照Trizol途径提取总RNA，紫外测总RNA的纯度及浓度。根据逆转录试剂盒将RNA反转录为cDNA;内参照β－action基因，每样本设3个复孔，real－time PCR按照说明书进行操作;反应条件为:95℃预变性30S，1个循环，95℃5S、60℃31S，扩增40个循环，95℃15S、60℃1min、95℃15S，进行产物溶解，并绘制溶解曲线。计算各样本的△Ct值(目的基因Ct值—内参基因Ct值)，各样本的相对定量为2—△Ct，组间表达差异用2—△△Ct(△△Ct=△Ct实验组—△Ct对照组)表示。

1.5 统计学分析

采用SPSS17.0软件进行统计学分析。数据以均数士标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间差异比较采用方差分析或多组设计(完全随机设计)的秩和检验。P＜0.05为有统计学差异，P＜0.01认为有显著性差异。

2 结果

2.1 各组CMECs增殖率、迁移率、成管率比较各组药物干预后，CMECs的增殖率、迁移率、成管率均呈现出正常组＞bFGF组＞通心络高剂量组＞通心络低剂量组＞模型组的趋势，与正常组比较其他各组均明显降低(P＜0.01)，bFGF组、通心络高剂量组、通心络低剂量组分别与模型组比较，均有显著差异(P＜0.05～0.01)，表明bFGF、通心络高剂量、通心络低剂量均有促进CMECs增殖、迁移、成管的作用，而bFGF组、通心络高剂量组与通心络低剂量组比较均有显著差异(P＜0.01)，bFGF组虽较通心络高剂量组检测值略高，但两组比较差异无统计学意义(P＞0.05)见表1。

表1 各组CMECs增殖率、迁移率、成管率比较

2.2 real－time PCR检测VEGF、bFGF的表达情况real－time PCR结果显示，与正常组比较模型组VEGF、bFGF的表达水平明显下调(P＜0.01)，与模型组比较，bFGF组、通心络高剂量组均能明显上调VEGF、bFGF的表达水平(P＜0.01，P＜0.05)，通心络高剂量组CMECs中VEGF、bFGF表达上调，其中VEGF表达水平显著高于其他各组(P＜0.01)，与bFGF组比较差异无统计学差异(P＞0.05)见表2。

表2 各组CMECs中VEGF、bFGF的mRNA表达情况

3 讨论

心肌微血管内皮细胞(Cardiac Microvascular Endothelial Cells，CMECs)是心脏微血管的基本构成单位，是正常心肌组织中数目最多的细胞，CMECs不仅可以调节微血管管腔直径以控制组织血流量，而且还能够通过旁分泌和自分泌功能，在心肌生长发育，组织代谢，收缩功能以及节律控制方面发挥重要作用。微血管的生成主要涉及①内皮细胞和周细胞的激活;②血管内皮基底膜降解，细胞外基质消化重吸收;③内皮细胞的分裂、增殖和迁移，通过不断伸展，彼此相连形成中空的管腔;④周细胞沿内皮移行，在二者联合作用下产生新的基底膜这4个阶段。血管内皮细胞通常是长期静止存在的，只有在适当的刺激活化后才会形成毛细血管［12－14］。发生缺血性心脏病时，机体内源性侧支循环的代偿是很有限的，即血管内皮细胞的血管新生能力是很有限的，如何有效建立侧支循环、促进血管新生成为保护缺血心肌的重要策略。

中医学认为缺血性心脏病的基本病机为气虚血瘀，益气活血己成为研究的主要方向。关于益气活血“生脉”、“生肌”等方面的理论历代文献著作已有诸多论述，与血管生成密切相关。我们的研究结果，各药物组干预后，CMECs的增殖率、迁移率、成管率呈现出正常组＞bFGF组＞通心络高剂量组＞通心络低剂量组＞模型组的趋势，通心络高剂量组对血管生成的不同环节均有明显促进作用并显著优于其他各组(P＜0.01)，与bFGF组比较无统计学差异(P＞0.05)。通心络高剂量组CMECs中VEGF、bFGF表达上调，其中VEGF表达水平显著高于模型组和低剂量组(P＜0.01)。表明通心络胶囊能够促进缺血CMECs“增殖”、“迁移”和“成管”，发挥自身血管搭桥的作用，其机制可能与上调VEGF、bFGF表达有关。

鉴于中药或有效成分具有多靶点、多环节、多层次的作用特点，而且中药复方在配伍后的作用较为复杂，深入探讨通心络胶囊促进缺血心肌血管生成的作用机制研究:一是选择符合中医证型的动物模型，最好是猪的模型，其血液循环与人类更加类似。二是基于中医阴阳理论，血管生成的机制应考虑到血管生长因子和抑制因子两个相互对立的方面，并在基因水平上进行阐明，为通心络胶囊对缺血心肌的促血管生成作用提供系统的科学依据。

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The effects of Tongxinluo capsule on the angiogenesis in rats of myocardial ischemia

ZHANG Bing－xin
(Shandong university of Chinese medicine basic medical school，Jinan 250014，China)

Objective:To investigate the effects of Tongxinluo capsule on the angiogenesis in rats of myocardial ischemia and its mechanisms.Methods:60 SD rats were divided into normal group，model group，low－dose group of Tongxinluo capsule，high－dose of group of Tongxinluo capsule and bFGF positive control group.We made the rat model of myocardial ischemia by ligate the anterior descending branch of coronary artery and culture the microvascular endothelial cells (CMECs)of myocardial muscles by explant method.We observe the intervention effects of Tongxinluo capsule and the control medicated serums on proliferation，migration，angioblast of CMECs.Real－time PCR was used to detect the expression level of VEGF，bFGF in different groups.Results:After the drug intervention，the tendency of proliferation rate，migration rate and angioblast rate of CMECs from high to low were normal group，bFGF positive control group，high－dose of group of Tongxinluo capsule，low－dose group of Tongxinluo capsule，model group consequently.High－dose of Tongxinluo capsule could facilitate the angiogenesis in different aspects and better than other groups(p＜0.01).Compared to the bFGF group，there was no statistically significance(P＞0.05.The levels of VEGF and bFGF were upregulated of CMECs in group of high－dose Tongxinluo capsule.The expression levels of VEGF were higher than the model group and the low－dose Tongxinluo capsule group(P＜0.01).Conclusion:Tongxinluo capsule could facilitate the proliferation，migration and angioblast in ischemic CMECs.It might have the effect of vascular bypass which might related to the upregulation of MEGF and bFGF.

tongxinluo capsule;myocardial ischemia;angiogenesis

R543

:A

:7115-1004(2015)06-0636-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2015.06.012

2015－3－15)

张冰睿(1991—)，女，山东泰安人，山东中医药大学基础医学院2011级。