壳聚糖对鱼腥草提取液絮凝除杂效果的研究

李思东,陈 松,何 明,杨锡洪,*,刘莉莉,庄巧玲

(1. 广东海洋大学食品科技学院,广东湛江 524088;2. 海南大学材料与化工学院,海南海口 570228;3. 广东海洋大学理学院,广东湛江 524088)

壳聚糖对鱼腥草提取液絮凝除杂效果的研究

李思东1,陈 松1,何 明2,杨锡洪1,*,刘莉莉1,庄巧玲3

(1. 广东海洋大学食品科技学院,广东湛江 524088;2. 海南大学材料与化工学院,海南海口 570228;3. 广东海洋大学理学院,广东湛江 524088)

研究了壳聚糖用量、pH和温度对鱼腥草提取液絮凝除杂效果的影响,并对其工艺进行了正交实验优化。实验结果表明最佳的工艺条件是壳聚糖用量为0.04g/100mL,提取液pH为6.0,温度为30℃;在此条件下,鱼腥草澄清液的黄酮保留率为80.0%,透光率高达68.1%。该工艺在絮凝除杂的同时又较好地保留了鱼腥草有效成分,具有良好的应用前景。

壳聚糖,鱼腥草提取液,絮凝,黄酮

鱼腥草为三白草科蕺菜属植物,是一种传统药用植物,分布在长江流域以南地区[1-2]。鱼腥草含有多种化学成分,主要活性成分为挥发油和黄酮类化合物[3-4]。已有研究表明鱼腥草中的黄酮类化合物具有抗疲劳[5]、抗氧化[6-7]、抗肿瘤[8]等功能。鱼腥草中的黄酮类物质主要包括槲皮素、槲皮苷、异槲皮苷、瑞诺苷、金丝桃苷、阿芙苷和芦丁等[9],芦丁常被用作测定和评价鱼腥草中的黄酮含量的指标[10-11]。

药用植物提取液是加工生产功能性食品的主要原料,但因其成分复杂,含有蛋白质、多糖、鞣质、树胶、色素、淀粉等,是非常混浊的胶体分散体系,需要进行澄清处理[12]。上世纪50年代后期至今,水提醇沉法被普遍采用,但醇沉法存在诸多不足,如乙醇耗量大、操作麻烦、成本高、工艺流程长,会除去具有降血糖、抗癌等功效的活性多糖,得到的制剂易产生沉淀或黏膜现象,使提取液的保健功能降低[13]。

近年来,大量天然高分子絮凝剂被用作药用植物提取液的澄清,如明胶、101果汁澄清、ZTC系列澄清剂及壳聚糖等[14-18]。壳聚糖以其成本低廉、具有生物降解性和良好的生物相容性、安全无毒,既能除去杂质,保证药液或制剂稳定,又能保留有效成分,缩短生产周期等优点,被广泛应用于药用植物提取液及其制剂的澄清精制[19]。本文以鱼腥草为原料,对壳聚糖絮凝除杂鱼腥草提取液的工艺进行研究,以期确定最佳工艺条件,为工业化生产应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鱼腥草 购自湛江益生药店;400ku分子量壳聚糖 湛江廉江市台兴生物科技有限公司;芦丁标准品 上海友思生物技术有限公司;其它试剂均为分析纯。

UV-5500型紫外可见分光光度计 上海分析仪器有限公司;RE52CS型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市英峪京华仪器厂;HHS型电热恒温水浴锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;PHS-25型实验室pH计 上海伟业仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 鱼腥草提取液的制备 将鱼腥草用剪刀剪为长度为0.5至1.0cm,称取40g鱼腥草置于圆底烧瓶中,加入900mL蒸馏水,在微沸状态下分3次回流提取,每次45min,过滤废渣,浓缩滤液至500mL,得到鱼腥草提取液。

1.2.2 壳聚糖絮凝除杂鱼腥草提取液的工艺优化 壳聚糖絮凝剂的制备:用1%(体积分数)的乙酸溶液为溶剂配制1%(质量体积分数)的壳聚糖溶液,在室温条件下先溶胀12h,然后低速搅拌,待完全溶解后便为壳聚糖絮凝剂。

1.2.2.1 单因素实验 壳聚糖用量对絮凝除杂效果的影响：取5份15.0mL的提取液,将pH调节至6.5,分别向提取液中加入0.6、0.9、1.2、1.5和1.8mL 壳聚糖絮凝剂和1.2、0.9、0.6、0.3、0.0mL 1%的乙酸溶液,即壳聚糖用量分别为0.04、0.06、0.08、0.10和0.12g/100mL(壳聚糖用量表示为每100mL提取液中壳聚糖的加入量(g))。在40℃下水浴搅拌10min,静置8h后过滤,将滤液浓缩至15.0mL,测定该澄清液的透光率和吸光度。

提取液pH对絮凝除杂效果的影响：取5份15.0mL的提取液,将pH分别调节为5.0、6.0、6.5、7.0和8.0,向提取液中加入0.6mL壳聚糖絮凝剂,在40℃下水浴搅拌10min,静置8h后过滤,将滤液浓缩至15.0mL,测定该澄清液的透光率和吸光度。

提取液温度对絮凝除杂效果的影响：取5份15.0mL的提取液,将pH调节至6.5,向提取液中加入0.6mL 壳聚糖絮凝剂,分别在30、40、50、60、70℃下搅拌10min,静置8h后过滤,将滤液浓缩至15.0mL,测定该澄清液的透光率和吸光度。

1.2.2.2 正交实验优化 以上述单因素实验得出壳聚糖用量、提取液pH和温度的3个水平,建立因素水平表(见下表1),以澄清液的透光率和黄酮保留率为指标,采用正交实验确定絮凝除杂工艺的最佳壳聚糖用量、提取液pH和温度。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.3 指标的测定及计算

1.2.3.1 黄酮含量的测定及其保留率的计算 测定方法主要参照参考国家药典[20]中方法,但是略有改动。

溶液的配制:准确称取120℃干燥至恒重的芦丁标准品20mg,用60%(体积分数)的乙醇超声溶解,并定容至50mL,得浓度为0.4mg/mL标准溶液。

标准曲线的绘制:准确吸取芦丁标准溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mL,置于7个50mL的容量瓶中。分别向每个容量瓶中加入6mL蒸馏水和2mL 5%(质量体积分数)的NaNO2溶液,摇匀后放置6min,再加入2mL 10%(质量体积分数)的Al(NO3)3溶液,摇匀后放置6min,然后加入12mL 4%(质量体积分数)的NaOH溶液,最后加蒸馏水至刻度,摇匀后放置15min。在510nm的波长处测定各溶液的吸光度。建立回归方程,绘制标准曲线。

黄酮含量的测定:取待测液1mL,按上述实验方法,在510nm的波长处测定吸光度,求得黄酮含量。

黄酮保留率的计算:黄酮保留率(%)=(澄清后提取液中黄酮含量/澄清前提取液中黄酮含量)×100。

1.2.3.2 透光率的测定 取适量的待测液,以蒸馏水为空白对照,在最佳波长680nm处测定透光率。透光率是澄清液澄清度的指标,透光率越大,澄清度越高,絮凝除杂效果就越好。

1.3 壳聚糖絮凝法与醇沉法澄清效果的比较

1.3.1 醇沉法 取提取液15.0mL,加入45.0mL 75%的乙醇,静置8h,待醇沉后过滤,将滤液浓缩至15.0mL,测定该澄清液的透光率和吸光度。

1.3.2 壳聚糖絮凝法 取提取液15.0mL,在正交实验优化后得出的最佳条件下进行澄清,静置8h后过滤,将滤液浓缩至15.0mL,测定该澄清液的透光率和吸光度。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线的绘制

以芦丁浓度(C)为横坐标,吸光度(A)为纵坐标作图,得到芦丁标准曲线(图1),其回归方程:A=11.375C+0.001(相关系数R2=0.999),由图可知,在0.01～0.06mg/mL范围内芦丁的浓度与吸光度具有良好的线性关系。

图1 芦丁浓度对吸光度的标准曲线Fig.1 Standard curve of concentration of rutin and the absorbance

2.2 壳聚糖用量对絮凝除杂效果的影响

壳聚糖用量对絮凝除杂效果的影响如图2所示。由图2可知,澄清液的透光率随着壳聚糖用量的增大出现先增大后下降的趋势,在用量为0.10mg/100mL时其透光率达到最大。这可能是因为壳聚糖用量较少时,随着壳聚糖用量的增大,被絮凝的胶体颗粒增多,从而使澄清液透光率提高;而当壳聚糖过量时,提取液中的某些胶体颗粒表面会吸附过量的壳聚糖,形成空间保护层,使这些颗粒处于较稳定状态,悬浮在液体中,导致澄清液透光率较低。黄酮保留率随着壳聚糖用量的增大而减小,这是因为壳聚糖对黄酮有一定的吸附作用。从图中可以得知,在壳聚糖用量为0.06mg/100mL时,澄清液的透光率和黄酮保留率都处于较高的水平。

图2 壳聚糖用量对絮凝除杂效果的影响Fig.2 Effect of dosage of chitosan on flocculation impurity removal

2.3 提取液pH对絮凝除杂效果的影响

提取液pH对絮凝除杂效果的影响如图3所示。由图3可知,在pH为5～8区间内,随着pH的增大,透光率和黄酮保留率都先增大后减小,且都在pH为6.5处达到最大值。透光率的变化可能受两方面原因的影响,一方面,壳聚糖在pH为4.9时质子化程度最大,随着pH增大,壳聚糖质子化程度逐渐降低,对胶体颗粒双电层的压缩能力减弱,导致絮凝除杂效果变差;另一方面蛋白质和鞣酸随pH增大,表面负电荷逐渐增加,变得更容易与壳聚糖发生絮凝作用。黄酮保留率的变化可能与其在弱酸环境有较高的稳定性有关。

图3 提取液pH对絮凝除杂效果的影响Fig.3 Effect of pH of extracting solution on flocculation impurity removal

2.4 提取液温度对絮凝除杂效果的影响

提取液温度对絮凝除杂效果的影响如图4所示。从图4中可知,在30～70℃范围内,随着温度增高,透光率先升后降,在50℃时达最大值。这可能是因为温度较低时,温度的升高加快了胶体颗粒的布朗运动,增加了与壳聚糖的碰撞次数,提高了絮凝效果;但温度过高,一方面使絮凝作用过快,导致絮状沉淀细小,沉降慢甚至无法沉降[19];另一方面,高温会使壳聚糖空间结构发生改变,导致絮凝活性下降。黄酮保留率先升后降再趋于平稳,在40℃时达最大值。综合考虑澄清液的透光率和黄酮保留率,40℃是较佳的温度。

图4 提取液温度对澄清效果的影响Fig.4 Effect of temperature of extracting solution on flocculation impurity removal

2.5 壳聚糖絮凝除杂工艺优化

正交实验结果如表2所示,壳聚糖对鱼腥草提取液絮凝除杂效果最佳的工艺应该使澄清液透光率较高,同时有效成分黄酮得到最大的保留,即黄酮的保留率越高越好。因此,在正交分析过程中需要综合考虑这两个指标,采用加权评分法对正交实验结果进行分析。黄酮保留率是反映澄清液功能性成分的重要指标,因此评分时这一指标有更高的权重,把评分公式定为:得分=透光率×0.2+黄酮保留率×0.8;得分越高表示其絮凝除杂的效果越好。

表2 L9(34)正交实验结果Table 2 L9(34)Design and results of orthogonal experiment

从表3中的极差分析可知,影响壳聚糖絮凝除杂鱼腥草提取液的效果的因素主次顺序是A>C>B,即壳聚糖的用量对澄清效果的影响最大,其次是提取液的温度,最后为提取液pH,确定的最优方案为A1B1C1,即最佳工艺条件为:壳聚糖用量是0.04g/100mL、pH6.0,温度30℃。正交实验获得的最佳因素与单因素实验之间存在着一定的差距,这可能是由于它们之间的交互作用引起的。在此最佳工艺条件下,进行验证性实验,测得澄清液的黄酮保留率和透光率分别为80.0%和68.1%。壳聚糖絮凝除杂鱼腥草提取液的工艺简单且澄清效果好,对鱼腥草中的有效成分也有较好的保留作用。

表3 极差分析Table 3 Range analysis

注：该表为加权得分的极差分析。

2.6 壳聚糖絮凝除杂法与醇沉法效果对比

壳聚糖絮凝除杂工艺与醇沉工艺的澄清效果对比如表4所示。由表4可知,壳聚糖澄清法能在获得与醇沉法相似的黄酮保留率的同时,大幅提高透光率,显著提高了鱼腥草提取液的澄清效果。

表4 壳聚糖絮凝除杂法与醇沉法效果的对比Table 4 Comparison of the clarification effect by chitosan and alcohol

3 结论

壳聚糖用量、提取液pH和提取液温度对壳聚糖絮凝除杂鱼腥草提取液的效果都有不同程度的影响,壳聚糖用量的影响最大,其次是提取液温度和提取液pH。许多研究学者都探究了相关因素对絮凝除杂效果的影响,一些研究学者[15,21-22]的结果也表明壳聚糖的用量对絮凝除杂效果影响最大。通过正交实验优化得出了最佳澄清工艺条件,即壳聚糖用量为0.04g/100mL,提取液pH为6,温度为30℃;在此条件下,黄酮保留率为80.0%,澄清液透光率达68.1%。与醇沉法相比,壳聚糖絮凝除杂法工艺简单、成本低廉、效果好,在保留有效成分的同时显著提高透光率,有良好的应用前景。

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Effect of chitosan on flocculation impurity removal of extracting solution from houttuynia

LI Si-dong1,CHEN Song1,HE Ming2,YANG Xi-hong1,*,LIU Li-li1,ZHUANG Qiao-ling3

(1. College of Food Science and Technology,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China;2. College of Materials and Chemical Engineering,Hainan University,Haikou 570228,China;3. College of Science,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China)

Effect of dosage of chitosan,pH and temperature of extracting solution on flocculation impurity removal of extracting solution from houttuynia were studied. Then the clarification process was optimized by orthogonal experiment. The results showed that the optimum process condition was that dosage of chitosan was 0.04g/100mL,pH of extracting solution was 6.0,temperature of extracting solution was 30℃. Under this condition,the flavones retention rate was 80.0%,the light transmittance was 68.1%,which indicated that using this method the active ingredients was well-preserved and the clarity was good. This method had good application prospect.

chitosan;extracting solution from houttuynia;flocculation;flavonoid

2014-04-18

李思东(1960-)，男，本科，教授，研究方向：海洋应用化学。

*通讯作者:杨锡洪(1963-)，男，博士，教授，研究方向：水产品质量与安全。

国家自然科学基金项目(31271938)。

TS201.2

B

1002-0306(2015)01-0259-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.045