徽州贡菊中熊果酸的高压脉冲电场技术(HIPEF)辅助提取及纯化工艺研究

孙克奎,金声琅,王 莹

(1.黄山学院旅游学院,安徽黄山 245021;2.青岛农业大学食品科学与工程学院,山东青岛 266109)

徽州贡菊中熊果酸的高压脉冲电场技术(HIPEF)辅助提取及纯化工艺研究

孙克奎1,金声琅1,王 莹2

(1.黄山学院旅游学院,安徽黄山 245021;2.青岛农业大学食品科学与工程学院,山东青岛 266109)

本文以徽州贡菊为原料,以熊果酸得率为指标,利用高压脉冲电场技术(HIPEF)辅助提取徽州贡菊中熊果酸。最后确定的最佳提取参数是:电场强度30kV/cm、脉冲数2、料液比1∶12、温度30℃,最终熊果酸的提取率可达97.577%;并确定了使用X-5大孔树脂,上样量60BV、pH11、吸附速率为2BV/h、洗脱剂用70%乙醇、2BV/h的洗脱速度纯化效果最佳,最终徽州贡菊熊果酸的纯度可以达到85%以上。

徽州贡菊,熊果酸,HIPEF辅助提取,纯化

徽州贡菊(Dendranthemamorifolium(Ramat.)Tzvel.Gongju)名列全国四大名菊之首[1]。徽州贡菊富含菊甙、腺嘌吟、氨基酸、胆硷、熊果酸、水苏硷、黄酮类及多种维生素[2-3]。其中熊果酸含量尤为丰富。熊果酸具有多种生物学活性,有抗病毒、抗肿瘤、降血脂和抗艾滋病等作用[4-5]。目前徽州贡菊已经实施原产地产品保护,推进无公害贡菊生产及品牌创建的产业化发展道路,由于市场上对贡菊的卖相十分看重,导致很多残次的贡菊失去了市场,造成了浪费。显然,单一的以茶用作为发展手段已不能满足现代发展的需要,对其进行深加工以提高其附加值显得刻不容缓。

本论文在前期研究的基础上,引入高压脉冲电场浸提技术,探讨其对徽州贡菊熊果酸的浸提和纯化工艺,以期提高徽州贡菊熊果酸的提取率,为进一步开发徽州贡菊的功能性产品提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

徽州贡菊 黄山市歙县采购;熊果酸对照品 安徽芜湖甙尔塔医药科技有限公司,HPLC 98%;HP2MG、HP2MGL、NKA-12、X-5大孔树脂 南开大学化工厂;NaOH、H2SO4、乙醇 武汉宏大化学试剂厂,均为分析纯;甲醇 天津科密欧化学试剂开发中心,色谱纯。

Waters 600型高效液相色谱仪 Waters公司;CS501型恒温水浴锅 中国重庆银河仪器有限公司;FA1204电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司;RE-52AA型旋转蒸发器 上海振捷实验设备有限公司;98-1-B型电子调温电热套 天津泰斯特仪器有限公司;XFB-500型高速中药粉碎机 吉首市中诚制药机械厂;高压脉冲电场(High Intensity Pulsed Electric Fields,HIPEF)系统装置 自制[6],如图1所示。

图1 HIPEF处理系统Fig.1 Processing apparatus of high intensity pulsed electric field

1.2 熊果酸的提取

1.2.1 提取方法 徽州贡菊经清洗后粉碎,过80目筛,筛下物加入一定比例95%乙醇并混合,然后放入HIPEF处理系统的样品容器中,用泵来抽取原料,使其在装置中循环流动。

1.2.2 熊果酸的测定 采用高效液相色谱法,色谱条件:Phenomenex Luna C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相为甲醇-3%磷酸(88∶12),微滤膜过滤并超声波脱气20min;流速2.0mL/min;检测波长210nm;进样量10μL;色谱温度为室温。

计算熊果酸提取率的方法参考相关文献[7],即提取率η(%)=浸出液中熊果酸的浓度(g/mL)×浸出液中熊果酸的体积(mL)/原料中熊果酸的质量(g)×100

1.2.3 HIPEF辅助提取的正交实验 每次取100g经预处理的徽州贡菊进行最佳提取工艺实验,根据多次预实验及以往相关实验经验[8-9],以加入的电场强度、脉冲数、料液比、提取温度作为考察因素,以熊果酸的提取量为评价指标,选择L9(34)正交表进行最佳提取工艺实验,实验方案见表1。

表1 正交因素及水平表Table 1 The factors and levels of experiment

1.2.4 对比实验 参考相关文献[7]采用传统的有机溶剂法浸提徽州贡菊中的熊果酸,并与HIPEF辅助提取法进行比较。

1.3 熊果酸的纯化

1.3.1 大孔树脂的筛选 取HP2MG、HP2MGL、NKA-12、X-5这4种大孔树脂进行实验,分别加入徽州贡菊提取液40mL,在室温下每5min振摇1次,24h后达到吸附平衡。测定这4种树脂对徽州贡菊中熊果酸的吸附率。加40mL质量分数为70%的乙醇溶液对上述吸附饱和的大孔树脂进行解吸,在室温下每5min振摇1次,24h后测定各种树脂对徽州贡菊熊果酸的解吸率。吸附率和解析率的计算方法参考相关文献[10-11]。

1.3.2 pH的筛选 取徽州贡菊提取液40mL,用1mol/L的盐酸或1mol/L的氢氧化钠将提取液的pH分别调整成3、5、7、9、11,加于X-5大孔树脂柱上,分别以2BV/h的流速吸附以及以5BV水洗脱,最后再由体积分数为70%的乙醇进行洗脱。

1.3.3 吸附速率的筛选 取徽州贡菊提取液40mL,用1mol/L的氢氧化钠将pH调整为11,加于X-5大孔树脂柱上,分别以1、2、3、4、5BV/h的流速进行吸附后,以5BV水洗脱,再用70%乙醇以2BV/h的速度洗脱,收集洗脱液测定熊果酸的浓度。

1.3.4 上样量的筛选 取徽州贡菊提取液40mL,用1mol/L的氢氧化钠将pH调整为11,加于20mL X-5大孔树脂柱上,以2BV/h的流速进行吸附,按树脂床体积数收集流出液,测定熊果酸的浓度。

1.3.5 乙醇洗脱浓度的筛选 取徽州贡菊提取液40mL,用1mol/L的氢氧化钠将pH调整为11,加于X-5大孔树脂柱上,以2BV/h的流速进行吸附,再以5BV水洗脱后,分别用10%、30%、50%、70%、90%的乙醇洗脱,收集洗脱液,测定熊果酸的浓度。

1.3.6 洗脱速率的筛选 取徽州贡菊提取液40mL,用1mol/L的氢氧化钠将pH调整为11,加于X-5大孔树脂柱上,用70%乙醇洗脱,流速分别为1、2、3、4、5BV/h,收集洗脱液,测定熊果酸的浓度。

1.3.7 单因素实验结果的验证 取徽州贡菊提取液40mL,用1mol/L的氢氧化钠将pH调整为11,加于X-5大孔树脂柱上,按照上述最佳参数进行纯化,并收集洗脱液,测定熊果酸的含量。然后水浴蒸干,于105℃干燥3h,测定干膏重,计算熊果酸的纯度。

2 结果与分析

2.1 熊果酸提取结果与分析

2.1.1 熊果酸提取结果 采用1.2.2色谱条件,图谱见图2,以吸光度y为纵坐标,熊果酸浓度x为横坐标,根据回归方程:y=5146.3x-3214.8,R2=0.9953,按1.2.2中提取率公式计算出熊果酸的浓度。

图2 HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatogram chart注:A.对照品溶液,B.样品+对照品溶液,C.供试品溶液。

2.1.2 正交实验结果 对正交实验结果进行方差分析,结果见表2和表3,综合实验结果可以得出,影响HIPEF辅助提取徽州贡菊中熊果酸的因素主次顺序为料液比>电场强度>温度>脉冲数。而且电场强度、料液比、温度三因素有极显著差异,脉冲数差异不显著;结合表2和表3,得出最佳提取参数是A3B2C3D2,即电场强度30kV/cm、脉冲数4次、料液比1∶12、温度30℃。

2.1.3 对比实验 本文应用HIPEF法、有机溶剂提法分别提取徽州贡菊中的熊果酸,通过单因素实验确定了各种方法的最优条件,即电场强度30kV/cm、脉冲数4次、料液比1∶12、温度30℃,在最佳参数下最终熊果酸的提取率可达97.577%,与第七组实验结果相同。由于第七组脉冲数更少,为减少能耗,则选用第七组的实验参数为最后使用参数,即电场强度30kV/cm、脉冲数2次、料液比1∶12、温度30℃。使用该方法远远高于传统有机溶剂法得到的提取率82.748%。经重复该参数实验验证,也确实达到了该提取率。该方法能够连续处理样品,非常适合工业化生产。

表2 正交实验分析Table 2 Analysis of orthogonal experiment results

表3 熊果酸提取率的方差分析表Table 3 The ursolic acid content in anova table

注:*p<0.1,**p<0.05,***p<0.01。

2.2 熊果酸纯化工艺结果与分析

2.2.1 大孔树脂的确定 从表4中可以看出,HP2MG、HP2MGL、NKA-12、X-5这4种树脂当中X-5大孔树脂对徽州贡菊熊果酸的吸附和解析能力最好,所以选择X-5大孔树脂进行纯化实验。

表4 4种大孔树脂对徽州贡菊熊果酸的吸附率与解析率Table 4 The adsorption rate and parse rate of huizhou gongju ursolic acid by 4 macroporous resin

2.2.2 pH考察结果 从表5中可以看出,当pH为11时,上柱后熊果酸的浓度达到了4.312mg/mL,解析率最高,因此选择pH为11作为最佳参数。

表5 pH考察结果Table 5 The result of pH values

2.2.3 吸附速率对熊果酸的影响 从表6中可以看出,当吸附速率为1BV/h时,吸附效果最好,熊果酸浓度达到了4.420,解析率最高。但吸附速率为2BV/h的解析率与吸附速率与1BV/h的解析值相差不大,且速度快了一倍,所以选择2BV/h吸附速率为最佳参数。

表6 吸附速率对熊果酸的影响Table 6 The result of the adsorption rate

2.2.4 上样量对熊果酸的影响 从表7中可以看出,上样量40BV为时开始泄漏,60BV时达到吸附最高值,故可选择60BV上量。

表7 样量对熊果酸的影响Table 7 The effect of the sample volume

2.2.5 不同乙醇浓度对熊果酸的影响 从表8中可以看出,当乙醇浓度从10%到70%,上柱后熊果酸的浓度逐步提高,乙醇浓度为90%时又开始降低,其中70%时洗脱效果最好,解析率达到90.454,因此选择乙醇浓度70%为最佳参数。

表8 不同乙醇浓度对熊果酸的影响Table 8 The effect of the ethanol concentration

2.2.6 洗脱速率对熊果酸的影响 从表9可以看出,以1BV/h和2BV/h洗脱的解析率都很高,且相差很小,本实验采用2BV/h的流速进行洗脱,以提高洗脱的效率。

表9 洗脱速率对熊果酸的影响Table 9 The effect of the rate of elution

2.2.7 验证性实验结果 从表10可以看出,在上样液pH11、吸附速率为2BV/h,上样量为60倍的床体积,选用体积分数为70%的乙醇溶液,2BV/h洗脱速率进行洗脱的工艺参数下,经X-5大孔树脂柱处理后的熊果酸纯度可达85%以上,且具有较好的重现性。

3 结论

应用高压脉冲电场辅助提取技术,通过正交设计实验考察了多种提取因素对徽州贡菊中提取熊果酸的影响,运用L9(34)正交设计表对电场强度、脉冲数、料液比、温度等四种因素进行优化,得出最优的熊果酸提取条件为:电场强度30kV/cm、脉冲数2、料液比1∶12、温度30℃,最终熊果酸的提取率可达97.577%,高于传统有机溶剂法得到的提取率。

表10 熊果酸纯度测定结果Table 10 The ursolic acid purity measurement results

利用大孔树脂对徽州贡菊熊果酸进行富集纯化实验。通过对四种大孔树脂对比实验,得出X-5大孔树脂为徽州贡菊熊果酸的理想吸附树脂。其纯化工艺参数为:上样液pH11、吸附速率为2BV/h,上样量为60倍的床体积,选用体积分数为70%的乙醇溶液,2BV/h洗脱速率进行洗脱。最终经X-5大孔树脂处理后的徽州贡菊熊果酸的纯度可以达到85%以上。

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High intensity pulsed electric fields(HIPEF)-assisted extraction and purification of ursolic acid from Huizhou Gongju

SUN Ke-kui1,JIN Sheng-lang1,WANG Ying2

(1.Tourism College,Huangshan University,Huangshan 245021,China;2.School of Food Science and Engineering,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China)

The effects of the HIPEF-assisted extraction of ursolic acid from Huizhou Gongju were preliminary investigated,in which the technical parameters were optimized. The optimal conditions were as follows:electric field intensity of 30 kV/cm,pulse number of 2,material-solvent ratio of 1∶12 and 30℃. Under these conditions,the extraction yield of ursolic acid can reach to 97.577%. The results showed that the X-5 macroporons resin had the best effect on the separation when the volume of drug 60BV with the adsorption-speed 2BV/h,pH11,and the volume of 70% ethanol with desorption-speed 2BV/h,and the purity of ursolic acid could reach to 85%.

huizhou gongju;ursolic acid;HIPEF-assisted extraction;purification

2014-02-17

孙克奎(1978-)，男，硕士，讲师，主要从事农产品加工及设备研究方面的研究。

2014年度安徽省教育厅自然科学研究重点项目(KJ2014A243)；2013年度安徽省高校重点研究基地招标项目(SK2013B484)。

TS255.5

B

1002-0306(2015)01-0207-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.034