纳豆芽孢益生杆菌的筛选鉴定及耐受性、抑菌能力的研究

曾祥燕,赵良忠

(邵阳学院生物与化学工程系,湖南邵阳 422000)

纳豆芽孢益生杆菌的筛选鉴定及耐受性、抑菌能力的研究

曾祥燕,赵良忠*

(邵阳学院生物与化学工程系,湖南邵阳 422000)

根据纳豆芽孢杆菌的生物学特性,从不同纳豆食品中筛选出具有较高纤溶活性的菌株4株,分别就它们对温度、pH、抗生素的耐受性以及对病原菌的抑制能力和对有益菌的共生能力进行研究,结果表明:KH-1和KH-9具有良好的对温度、pH、抗生素耐受性及对病原菌的强抑制能力和对有益菌的共生能力。

筛选,鉴定,纳豆芽孢杆菌,耐受性,抑菌能力

益生菌是指具有生物活性,摄入适当量时可以对宿主产生有益作用的微生物[1]。纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)是益生菌的一种,从日本的传统发酵食品纳豆中发现并分离出来的,属于细菌科、芽孢杆菌属,是枯草芽孢杆菌的一个亚种[2]。纳豆芽孢杆菌作为美国FDA公布的40种益生菌之一,具有抗菌、促消化和提升免疫力功能,纳豆激酶是纳豆菌在发酵大豆时向胞外分泌的一种易溶于水的碱性蛋白质,它具有溶血栓和抗菌抑菌等作用[3]。纳豆菌能促进双歧杆菌、乳酸杆菌和梭菌等厌氧菌的生长,有效抑制肠道中肠杆菌和肠球菌等需氧菌的数量,保持宿主肠道微生态平衡。该菌对温度耐受性越高,在日常的保存及制粒中的生存能力就越强;对pH的适应能力越强,则就越能较好地适应胃肠环境;对抗生素的适应能力越强,则就越能与抗生素进行配伍协调式的同时使用,抑制病原菌的能力越强,则对畜禽疾病的治疗效果就越显著[4]。微生态制剂是用益生菌经培养而制成的活菌制剂,产品无污染、无毒副作用,在使用时多制成该菌休眠状态的活菌制剂[5-6]。对温度、pH、抗生素具有良好耐受性、对病原菌有强抑制能力以及对有益菌有很好共生能力,是益生菌进入肠道后较好发挥作用的基本条件。本研究从各种豆类中筛选鉴定出纳豆芽孢杆菌四株,分别就它们对温度、pH、抗生素的耐受性进行探讨,为纳豆芽孢杆菌在混合微生物饲料活菌制剂的开发提供一定的技术参数。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验菌种面包酵母、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母、脂肪芽孢杆菌、红发夫酵母、大肠杆菌等菌种来源于华南理工大学食品学院和康瑞德公司;20种不同品牌的豆豉 主要源于武汉市场、湖南邵阳市场、华南理工大学市场、五山市场和康瑞德公司,其中包括黄豆、绿豆、豌豆和纳豆等,将豆豉分别标号:KH-1、KH-2、KH-3……KH-20。米糠、米粉、糊精、玉米淀粉 四种载体;米糠、米粉自制;糊精、玉米淀粉来源于广州双桥股份有限公司。固体培养基Ⅰ(g/L) 牛肉膏5,蛋白胨10,NaCl 5,pH 7.2～7.4,琼脂20;液体培养基(g/L) 胰蛋白胨5,牛肉浸粉1,酵母浸粉2,NaCl 5,pH7.2～7.6;固体培养基Ⅱ(g/L) 胰蛋白胨5,牛肉浸粉1,酵母浸粉2,NaCl5,pH7.2～7.6,琼脂20;LB培养基(g/L) 胰蛋白胨10,酵母浸粉5,NaCl10,pH7.0,琼脂15;D-果糖 上海源聚生物科技有限公司;D-木糖 上海博奥生物科技有限公司;L-苯丙氨酸 上海博奥生物科技有限公司;D-甘露醇 索莱宝生物科技有限公司。

表1 不同pH溶液的配制Table 1 Confection of different pH solution

LS-2超净工作台 上海市沪新净化设备厂;CS10电热鼓风干燥箱重庆实验设备厂制造;L05-2A低速离心机 北京医用离心机厂;HH.S11-2电热恒温水浴锅 北京长安科学仪器厂;PYX-DHS-40X50隔水式电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂;THZ THZ-C恒温振荡器 江苏太仓市实验设备厂;PHS-2C型酸度计 上海虹益仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种鉴定 纳豆芽孢杆菌属于枯草芽孢杆菌属,利用产纳豆激酶这一特征可以从大量的豆豉中进行快速有目的地筛选所需的菌株,许多学者认为其与枯草芽孢杆菌十分相似,故学者们都以枯草芽孢杆菌的特征作为其鉴定指标[7],进行个体形态镜检和生理生化特征实验,包括过氧化氢酶实验、V.P实验、发酵葡萄糖产酸实验、酪蛋白(酪氨酸)水解实验、明胶水解实验、硝酸盐还原实验、吲哚实验等实验。

产过氧化氢酶实验:从斜面挑取一环菌种置于结晶的试管内,滴加3%的过氧化氢溶液约2mL,如在半分钟内产生气泡者,为过氧化氢酶实验阳性,不产生气泡者为阴性。

V.P实验(乙酰甲基甲醇实验):将待鉴定的菌种接种缓冲葡萄糖蛋白胨水培养基试管中(验证一下重现性),然后在(36±1)℃恒温箱中培养2～4d;在上述试管中分别按培养基一半的量加入6%的α-萘酚酒精液,摇匀,再按培养液三分之一的量加入40%的氢氧化钾液,充分摇动,观察结果,呈现红色者为V.P实验阳性,不呈现红色者,为阴性。

糖发酵实验:配制不同糖类的水杨素发酵实验培养基,按不同的糖类分装试管,贴上相应的标签,并在各试管中倒置一支杜氏小管,将上述试管置于(36±1)℃恒温箱中培养,24、48与72h各观察记录一次,若观察的实验结果中紫色的培养基变黄者,表明产酸。

酪蛋白(酪氨酸)水解实验:以划线接种法将实验菌接种于酪蛋白(酪氨酸)琼脂培养基上,然后置于37℃的恒温箱中培养1～2d,观察结果,平板中菌落周围有透明圈者,为酪蛋白(酪氨酸)分解实验阳性,反之为阴性。

明胶的水解实验:取含明胶培养基的试管两支,一支针刺接种实验菌于明胶培养基中,另一支作为空白对照,37℃培养5d,然后取出,置冰箱中20min,若空白实验管凝固,而接种有实验菌的管内明胶培养基仍为流体,则表明其可以液化水解明胶。

硝酸盐还原实验:将配制好的硝酸盐培养基分装于试管中,接入菌种,连同空白培养基一起置于37℃培养1～4d,在空白管中一次加入2%的淀粉溶液3滴,6mol/L HCl 5滴,5%的碘化钾2滴,摇匀,若颜色变蓝,表明培养基中混有亚硝酸盐,应该重新配制培养基进行实验,若颜色没有变蓝,表明培养基合格;继续按上述的滴加对发酵液进行实验,若颜色变蓝,表明硝酸盐被还原,为阳性,反之为阴性。

吲哚实验:将测试菌接种于蛋白胨水培养基中,37℃培养1～2d,必要时培养4～5d;取培养好的试管,加入约0.5mL的乙醚,振摇均匀后,静置分层,再沿管壁加入约0.5mL的吲哚试剂,阳性者试剂层呈玫瑰红色,否则为阴性。

1.2.2 耐受性和抑菌效果的实验 分别就它们对温度、pH、抗生素的耐受性以及对病原菌的抑制能力和对有益菌的共生能力进行研究,方法如下[8-9]。

1.2.2.1 纳豆芽孢杆菌对温度的耐受性 用同样的液体培养基将鉴定所得的菌株培养60h后3500r/min离心30min,取用发酵上清液1mL,其稀释至一定的倍数,于93、98℃水中保温5、10、15、20min,然后冷却,以室温下未经水浴的菌株对照,采用平板计数法计算存活率,据此判断其对温度的耐受性。

1.2.2.2 纳豆芽孢杆菌对pH的耐受性 配制两种不同的pH缓冲液,取不同的量配成不同pH的溶液,配制方法见表1,其中:A液为0.1mol/L的柠檬酸溶液,B液为0.2mol/L的磷酸氢二钠。

将菌株采用同样的液体培养基培养60h后3500r/min离心30min,取用发酵上清液1mL分别加入10mL对应的无菌缓冲液中,涂布平板计数,计算相对存活率,以此判断其pH的耐受性。

相对存活率(%)=pH处理后的每组实验组存活平均菌数/Max(pH处理后的每实验组存活平均菌数

1.2.2.3 纳豆芽孢杆菌对抗生素的耐受性 采用阿散酸、土霉素、抗敌素等几种抗生素及推荐剂量进行实验。用直径为6mm的圆形纸片,浸入对应的抗生素溶液中,浸泡2h,取出后阴干备用。

将菌体培养60h后,与固体培养基混匀,保持菌数在109～1010cfu/mL之间,取15mL液体倒入平板,待分散均匀干固后,将无菌的纸片放入平板上培养24h后测定抑菌圈的大小。

表2 纤溶活性Table 2 Fibrinolysis activity

1.2.2.4 纳豆芽孢杆菌的抑菌效果 将待实验的菌种和纳豆芽孢杆菌培养48～60h,然后对纳豆发酵液进行离心分离,用实验菌种涂板后贴上直径6mm的纸片,然后涂上10μL的纳豆上清液于纸片上点,在37℃恒温下培养24～48h,测量抑菌圈[10-12]。

1.3 数据处理与分析

采用excel绘图和制表,用SPSS进行因素方差分析,数据以平均值±标准差表示,结果p<0.01为极显著,p<0.05为显著,p>0.05为不显著。

2 结果与讨论

2.1 纤溶活性

纤溶活性是许多纳豆芽孢杆菌具有的特性,同时这种纤溶活性也有助于益生菌在畜禽肠道内发挥好的作用,基于这种原因对20个平皿的菌株进行筛选,实验结果见表2。从上述平皿中挑取KH-1、KH-4、KH-7、KH-9、KH-10、KH-14、KH-17单菌落各3株接种于试管斜面,培养24h后置于4℃的冰箱保存,选择以纤溶活性强的菌株进行进一步的鉴定实验。

2.2 生理生化特性

以枯草芽孢杆菌为对照,各项具体指标结果见表3。

菌株的纤溶活性越强,则其为纳豆芽孢杆菌的几率也越大,为了尽快鉴定出所需菌种,本实验采用了单项和多项逐一淘汰法,在鉴定的过程中,待鉴定菌株如有两项以上不符合鉴定的标准,即予以淘汰,而不再进行下面进一步的鉴定实验。经过纤溶活性和生理生化特性实验初步筛选和鉴定,得到了KH-1、KH-4、KH-9和KH-14的菌株初步鉴定为纳豆芽孢杆菌,分别就它们对温度、pH、抗生素的耐受性进行进一步的探讨实验。

2.3 纳豆芽孢杆菌对温度的耐受性

益生菌菌株在制粒的过程中经常瞬时高温,菌株对温度的耐受性越强,菌株的活性保存时间越长,越不容易受温度影响而死亡。实验选用了93℃和98℃两温度下进行了实验,结果如表4。实验表明:四种菌株的存活率受温度的影响很大。在93℃和98℃的条件下,同样的处理5min,同一菌株之间的存活率相差达40%左右;随着处理时间的延长,两者之间存活率的差值缩小,处理10min后,二者的存活率差值约15%左右,当处理时间达到20min时,四种菌株除KH-9还有0.5%的存活率外,其余的全部被杀死。

同时,由表4可知,除KH-14对温度的耐受性差一些外,其余的三种菌株相差不是很大。总体而言,在高温下,处理的时间如不是很长,各菌株还是会有很高的存活率,在93℃处理5min,它们仍还具有90%的存活率,能够承受饲料制粒过程中80～100℃的瞬时高温膨化,这四种菌株对温度的耐受性相较很强。

2.4 纳豆芽孢杆菌对pH的耐受性

一般动物肠道的pH多为酸性,在pH2～3及pH5～7两个范围,纳豆芽孢杆菌对pH的耐受性越强,它进入动物肠道后增殖和发挥作用的效果就越好,另外,在菌剂生产使用过程中,也常常会遇到不同的pH,因此,对pH有较强的适应性是发挥良好作用的前提条件。四种菌株对pH的耐受性见表5。

由表5可以看出,四种杆菌在pH7.10的环境中,存活率达95%以上;在pH5.10～7.10的范围内,存活率都可以达到75%以上,存活率很高;在pH2.10～5.10的范围内,pH对四种菌株的存活率影响较大,在pH2.10～3.20时,活菌株的损失率过半;四种杆菌在中性环境下,存活率最高,随着pH的下降或升高,存活率越来越低,对四种菌株pH的耐受性进行比较的结果是KH-14最差,KH-1的耐受性最好。由表5的数据结果,通过SPSS进行分析,四种杆菌在不同的pH中存在显著性差异(p<0.05)。

2.5 纳豆芽孢杆菌对抗生素的耐受性

纳豆芽孢杆菌对抗生素耐受性的结果见表6,抑菌圈直径越小,表明该杆菌对特定的抗生素耐受性越好。根据纸片法药敏判定标准,抑菌圈直径0mm为不敏,0～10mm为低敏,10～15mm为中敏,大于15mm为高敏。根据该看法,对抗生素的耐受性实验表明:四种菌株除了对球克表现为中敏度外,其余基本上都表现为低敏度,但相对而言,KH-1对实验用抗生素的耐受性最好,除对球克低敏外,其余的都表现为不敏,KH-1对抗生素有最好的配伍性能。

表3 纳豆芽孢杆菌的鉴定Table 3 Identification of bacillus subtilis natto

注:-,90%以上的菌株是阴性;+,90%的菌株是阳性;D,11～89%的菌株是阳性。

表4 a、b、c纳豆芽孢杆菌存活率与温度的关系Table 4 Relation of bacillus subtilis natto’s livability to temperatures

表5 纳豆芽孢杆菌存活率与pH的关系Table 5 Relation of bacillus subtilis natto’s livability to pH values

表6 纳豆芽孢杆菌对抗生素耐受性Table 6 Endured ability test of bacillus subtilis natto to antibiotic

表7 纳豆芽孢杆菌的抑菌效果Table 7 Restrain effect of bacillus subtilis natto on other strains

注:-代表无抑菌圈。

2.6 纳豆芽孢杆菌的抑菌效果

一般而言,动物肠道内含有大量的菌群,其中有些是对畜禽有益的,而有些是对畜禽有害的,本实验的目的在于通过比较四种菌株对所选用细菌群的抑制能力大小,从中选出对有害菌抑制能力强,对有益菌生长的抑制能力尽可能小的菌株,这样将有益于肠道内有益菌群的增生和有害细菌的抑制,起到防治畜禽疾病和促进生长等方面的功效。纳豆芽孢杆菌对菌群的抑制能力的结果见表7。

四种菌株对其它菌的抑菌实验结果表明:四种菌株对腊样芽孢杆菌DM423、枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌三种益生菌没有抑制性,KH-14对脂肪芽孢杆菌有一定的抑制性,KH-9对黑曲霉没有抑制性,四种菌对沙门氏寒菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有较强的抑制性,此外,四种菌对面包酵母和啤酒酵母有较强的抑制性。四种菌株与其它的益生菌能够共生,并对有些致病菌有较强的抑菌效果。对比四菌株,KH-1和KH-9对有益菌的抑制相对较小,而对有害菌的抑制性则较大。

3 结论

通过对温度、pH、抗生素的耐受性以及对病原菌的抑制能力和对有益菌的共生能力进行研究,得出如下结论:KH-1和KH-9相较KH-4和KH-14而言,前二者具有良好的对温度、pH、抗生素耐受性及对病原菌的强抑制能力和对有益菌的共生能力;KH-4对pH的耐受性较差,在动物肠道内(pH2～3),菌株的存活率较低,损失较大;而KH-14对温度和pH的耐受性都较差。综合比较各种菌株的特性,KH-9和KH-1对温度、pH、抗生素耐受性及对病原菌的强抑制能力和对有益菌的共生能力较强。

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Study on screening and identification,endured abilities and restraining the nocuous abilities ofbacillussubtilinatto

ZENG Xiang-yan,ZHAO Liang-zhong*

(Department of Biology and Chemical Engineering,Shaoyang University,Shaoyang 422000,China)

Fourbacillussubtilisnattoes screened out from different natto food were researched according to the Baeterium’s properties. There are essential conditions for probiotics to exert excellent function in digestive system,for instant having the higher endured abilities to temperature,pH and antibiotic,restraining the nocuous strains’ growth and coexistenting grow with probiotic. Results showed KH-1 and KH-9 not only had good endured abilities to temperature,pH,antibiotic,but also had good abilities to restrain the nocuous strains’ growth and to coexistent grow with probiotic.

screening;identification;bacillussubtilinattoes;endured abilities;restraining the nocuous

2014-03-28

曾祥燕(1974-)，男，副教授，硕士，主要研究方向：食品生物技术。

*通讯作者:赵良忠(1962-)，男，硕士，教授，研究方向：果蔬加工。

TS201.3

A

1002-0306(2015)01-0160-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.025