不同产区18种蓝莓提取物抗氧化与抑菌作用研究

姜文洁,孙晓红,*,朱 颖,杨 晗,刘晓钰，吴启华,潘迎捷

(1.上海海洋大学食品学院,上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海 201306;2.美国缅因大学食品与农业学院,缅因 04469)

不同产区18种蓝莓提取物抗氧化与抑菌作用研究

姜文洁1,孙晓红1,*,朱 颖1,杨 晗1,刘晓钰1，吴启华2,潘迎捷1

(1.上海海洋大学食品学院,上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海 201306;2.美国缅因大学食品与农业学院,缅因 04469)

本文以18种栽培蓝莓的乙醇提取物为研究对象,利用体外法研究了不同产区蓝莓提取物对DPPH自由基和羟基自由基的清除作用及还原能力,分别采用福林酚法、亚硝酸钠法和pH示差法测定了18种蓝莓中总酚、黄酮及花青素的含量,同时利用试管二倍稀释法测定了不同产区18种蓝莓提取物对副溶血性弧菌的抑制作用。结果表明,不同产区18种蓝莓对DPPH自由基及羟基自由基均具有良好的清除作用,对DPPH自由基清除率的范围为11%～65%,对羟基自由基清除率的范围为20%～64%,杭州产区的蓝莓还原能力强于上海及青岛两个产区;不同产区18种蓝莓的总酚、黄酮及花青素含量不同,总酚含量较高的蓝莓具有较好的抗氧化能力;不同产区18种蓝莓粗提液对副溶血性弧菌表现出不同程度的抑制作用,其MIC值最小的为15.625mg/mL,最大的为250mg/mL。由此可以得出,不同产区不同品种蓝莓在功能和活性成分上存在差异。

不同产区,蓝莓提取物,抗氧化,抑菌作用

蓝莓(Blueberry),又称越桔,属于杜鹃花科越橘属多年生常绿灌木。果实呈现深蓝色,外面裹有一层白色果粉,酸甜适口,风味独特,具有极高的营养价值。蓝莓含有丰富的多酚类物质,具有抗氧化、抗癌、抗炎症、抗衰老及预防心血管疾病等多种生理活性功能[1]。自1983年我国引种蓝莓以来,全国蓝莓种植企业及大型种植户不断增加,累计约200多家,各类蓝莓品种超过200个,种类繁多。

国内外很多研究者对蓝莓的抗氧化能力进行过探讨。周方等[2]通过对6个高丛蓝莓品种的花青素含量及抗氧化能力研究发现,品种埃利奥特表现出较强的 DPPH 自由基清除能力和总还原能力,有较好的抗氧化效果。姜爱丽[3]等人对四个品种北高丛蓝莓进行了抗氧化活性研究。Wang等[4]人以不同品种的兔眼蓝莓为对象,研究了不同品种之间的抗氧化能力差异。关于蓝莓抑菌能力方面的报道,国外比较常见。Chatterjee等[5]发现蓝莓对clarithromycin有抗药性的幽门杆菌(49503)有抑制作用,或加强其对clarithromycin的敏感性。Caillet[6]等人研究结果表明,蓝莓提取物对沙门氏菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌等致病菌均有一定的抑制作用。目前,国内尚未有关于不同产区不同品种蓝莓抗氧化和抑菌功能及其活性成分的研究。因此,本研究以我国三个地区18个不同品种蓝莓作为研究对象,测定了其总酚含量、花青素含量以及黄酮成分含量,对抗氧化功能以及抑菌功能进行了探讨,为蓝莓栽培和开发蓝莓保健食品等提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

爱国者,蓝丰,北青及尼尔森4个品种 购自青岛沃林蓝莓有限公司;园蓝,森吐里昂,杰兔,巨丰,粉蓝,顶峰,精华,梯芙蓝8个品种 购自杭州贝莱特蓝莓综合开发有限公司;奥尼尔,蓝丰,粉蓝,灿烂,日出及H31 6个品种 购自上海金山敏蓝蓝莓专业合作社;实验用三株副溶血性弧菌:ATCC33847、ATCC17802购自中国科学院微生物研究所,F36由本实验室分离并保存,菌株于-20℃冰箱保存。

1,1-苯基-2-苦肼基自由基(DPPH) 购自Sigma公司;过氧化氢,硫酸亚铁,水杨酸,磷酸二氢钠,磷酸氢二钠,铁氰化钾,三氯乙酸,三氯化铁,无水乙醇,亚硝酸钠,硝酸铝,氢氧化钠,碳酸钠,没食子酸,芦丁标准品,福林酚等 购自国药集团化学试剂有限公司。

超声清洗仪SK5200HP 上海科导超声仪器有限公司;旋转蒸发仪 上海申生科技有限公司;循环水真空泵SHB-3 上海申生科技有限公司;电热恒温水浴锅 上海申生科技有限公司;8010s 匀浆机 Waring Commerial;隔水式恒温培养箱 上海一恒科技有限公司;ESCO超净工作台 美国Airstream公司;Bio-Tek酶标仪 美国伯腾仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蓝莓粗提液的制备 参考谢庆超等[7]方法制备蓝莓粗提液。

1.2.2 不同产区18种蓝莓粗提液对DPPH·的清除作用 不同品种蓝莓粗提液对DPPH·的清除作用参照Cerezo等[8]的方法进行改进。用无水乙醇配制0.1mmol/L的DPPH溶液,避光保存。具体实验步骤按照表1进行。将反应体系充分混匀,室温下避光静置30min。反应结束后,在517nm处测定吸光度值。0.5mg/mL抗坏血酸作为阳性对照。

其自由基清除率按照公式(1)进行计算

式中:Sa表示DPPH自由基清除率,Ai表示实验组,Aj表示空白实验组,A0表示对照实验组。

表1 DPPH·法反应体系Table 1 Method of DPPH·

1.2.3 不同产区18种蓝莓粗提液对OH·的清除作用 参照Smironff等[9]的方法做改动,反应体系包括1mL H2O2(8.8mmol/L),1mL FeSO4(9mmol/L),1mL水杨酸-乙醇(9mmol/L),样品溶液1mL,最后加入H2O2启动整个反应,37℃条件下反应30min。由于蓝莓粗提液本身具有吸光值,以1mL FeSO4(9mmol/L),1mL水杨酸-乙醇(9mmol/L),1mL样品溶液及1mL蒸馏水作为蓝莓粗提液的本底吸收值。其自由基清除率按照公式(2)进行计算。其中0.5mg/mL抗坏血酸作为阳性对照。

式中:Sa表示OH自由基清除率,A0表示空白对照的吸光度,AX表示加入样品的吸光度,AX0表示样品的本底吸光度。

1.2.4 还原能力实验 参照李颖畅等[10]的方法,略做改动。取一定浓度的样品溶液2.5mL于试管内,依次加入2.5mL 0.2mol/L磷酸盐缓冲液,2.5mL 1%的铁氰化钾,于50℃水浴保温20min后,快速冷却,再加入2.5mL 10%三氯乙酸(TCA),以3000r/min离心10min,取上清液2.5mL,加入2.5mL蒸馏水,0.5mL 0.1%的三氯化铁溶液,充分混匀,静置10min后在700nm处测定吸光度值,吸光度越大,表示样品的还原能力越强。以0.5mg/mL抗坏血酸作为本实验的阳性对照。

1.2.5 总酚含量的测定 总酚含量采用Folin-Ciocalte[11]的方法进行测定,以没食子酸作为标准物质。没食子酸标准曲线的绘制:准确称取没食子酸标准品0.05g,配制成0.1mg/mL的没食子酸标准溶液。分别移取标准品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于2mL离心管中,加超纯水至1mL,加入0.4mL Folin-Ciocalte试剂,混合均匀后再加入0.8mL质量分数为10%的Na2CO3饱和溶液,定容至5mL,室温下静置2h,在770nm波长处测定吸光度。以没食子酸的质量浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制没食子酸标准曲线。样品总酚含量的测定:准确吸取一定浓度的样品溶液100μL,定容至1.0mL,加入0.4mL Foiln-Ciocalte试剂以及0.8mL 10% Na2CO3饱和溶液,定容至5mL,室温下静置2h,总酚含量表示为没食子酸的当量,实验重复3次。

1.2.6 黄酮含量的测定 黄酮含量采用NaNO3-AI(NO3)3的方法[12]测定,以芦丁作为标准物质。芦丁标准曲线的绘制:准确移取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL浓度为0.11mg/mL的芦丁标准溶液于试管中,加入60%乙醇溶液至5mL,加入0.3mL质量分数为10%的亚硝酸钠溶液,混合均匀放置3min;再加入质量分数10%硝酸铝溶液0.3mL,放置6min;加入8%氢氧化钠溶液2.0mL,最后用60%乙醇定容至10mL,混匀放置15min,分别于500nm处测定吸光度值。以芦丁浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。样品黄酮含量的测定:吸取样品溶液500μL,用60%乙醇定容至5mL,按照标准曲线的测定方法,加入显色剂,在500nm处测定吸光度值。黄酮含量表示为芦丁当量,实验重复3次。

1.2.7 花青素含量的测定 采用pH示差法[13]进行花青素含量的测定,以矢车菊-3-葡萄糖苷为参照。取蓝莓粗提液1mL,加入pH4.5的0.4mol/L的醋酸钠缓冲液或pH1.0的0.025mol/L氯化钾缓冲液4mL,摇匀。分别在520nm和700nm波长处测定其吸光度值。实验重复进行3次。花青素含量按照以下公式进行计算:

式中,C为蓝莓中花青素的含量,mg/L;A=(OD520-OD700)pH1.0-(OD520-OD700)pH4.5;ε:摩尔吸光系数,以矢车菊-3-葡萄糖苷的摩尔系数进行计算,为26900;MW为矢车菊-3-葡萄糖苷的摩尔质量,为449.2g/mol;DF为稀释因子。最终以1g试样中含有花青素的量(mg)来表示。

1.2.8 蓝莓提取液对副溶血性弧菌的抑制作用 参照吕平等[14]的方法,采用试管二倍稀释法。取8支无菌试管,向第1至第7支试管中加入2mL TSB;在第1支试管中加入2mL蓝莓提取物原液(1000mg/mL),混匀后再吸取2mL至第2支试管,如此倍比稀释至到第6支试管,混匀后吸取2mL弃去。第7支试管为不加蓝莓提取液的生长对照。第8支试管加入2mL无菌TSB和2mL蓝莓提取液,混匀后弃去2mL。最终使第1支试管至第6支试管的蓝莓粗提液浓度分别为1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625mg/mL。向7支试管中加入10μL四种菌的菌液,37℃下培养24h后,进行10倍稀释,取合适梯度涂TCBS平板,于恒温培养箱中培养24h,以菌落数无变化的最低蓝莓提取物的浓度为MIC值,以菌落数不超过5个的最低蓝莓提取物的浓度为MBC值。实验重复进行3次。

1.2.9 数据处理 利用SPSS17.0以及Origin8.0进行数据统计分析及作图。

2 结果与讨论

2.1 不同产区18种蓝莓粗提液对DPPH自由基的清除作用

由图1可以看出,不同产区不同品种蓝莓对DPPH自由基的清除作用存在差异,抗坏血酸对DPPH自由基的清除能力较强,其DPPH自由基清除率远高于其他18个品种。这可能与本实验中蓝莓的提取方法有关,本实验以蓝莓粗提液为对象,没有进一步纯化,导致其DPPH自由基清除能力与抗坏血酸差距较大。18个品种中,清除DPPH自由基能力的前三位排序为:森吐里昂>杰兔>园蓝,其中森吐里昂的DPPH自由基清除率高达65.06%±0.04%,最后三位排序为尼尔森<精华<北青,尼尔森的DPPH自由基清除率仅为10.79%±0.02%。Scalzo等[15]研究表明水果的基因型不同可以导致水果的抗氧化能力不同,与本研究相符,主要是由于不同品种蓝莓本身的遗传信息不同导致它们的DPPH自由基清除能力存在差异。对于3个产区的蓝莓,产于杭州种植基地的蓝莓DPPH自由基清除能力比产于上海的蓝莓DPPH自由基清除能力强,而青岛的四个蓝莓品种的DPPH自由基清除能力相对较弱。Sun等[16]对我国9种兔眼蓝莓的抗氧化能力进行了研究,结果表明9种兔眼蓝莓对DPPH自由基均具有清除作用,主要是由于蓝莓中所含的花青素所引起的。胡可等[17]研究表明光是影响花青素苷合成最重要的环境因子之一。由于杭州蓝莓种植基地是露天种植,地理位置是在山坡上,蓝莓果实能够接受充足的阳光。由此推断,充足的阳光促进了蓝莓中花青素苷的合成,因此杭州蓝莓品种表现出比其它两个地区更强的DPPH自由基清除能力。

图1 18种蓝莓粗提液对DPPH·的清除作用Fig.1 The DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)radical scavenging activity of eighteen cultivars of blueberry extracts

图2 18种蓝莓粗提液对羟基自由基的清除作用Fig.2 The hydroxyl radical scavenging activity of eighteen cultivars of blueberry extracts

2.2 不同产区18种蓝莓粗提液对羟基自由基的清除作用

羟基自由基是目前所知活性氧自由基中对生物体毒性最强、危害最大的一种自由基,对细胞内DNA的破坏作用最大[18]。由图2可以看出,不同产区不同品种蓝莓清除羟基自由基的能力存在差异,抗坏血酸的羟基自由基清除率高于其他18个品种的蓝莓。18个品种中,青岛的爱国者清除羟基自由基的能力最强,其自由基清除率达到64.4%±0.02%,清除羟基自由的能力最差的为杭州的顶峰,清除率仅为20.2%±0.02%。对于3个产区的蓝莓,青岛产区的蓝莓清除羟基自由基能力相对较强。

2.3 不同产区18种蓝莓粗提液还原力实验

由图3可以得出,18种栽培蓝莓的还原能力存在差异,抗坏血酸的还原能力比其他18个品种蓝莓的还原能力强,大约是还原能力最强的森吐里昂品种还原能力的1.16倍。18个品种中,还原能力较强的品种有森吐里昂(杭州),爱国者(青岛),巨丰(杭州),粉蓝(上海),园蓝(杭州);还原能力较差的品种有蓝丰(青岛),尼尔森(青岛),奥尼尔(上海)。来自三个区域的蓝莓品种,杭州蓝莓品种的还原能力强于上海蓝莓品种,强于青岛蓝莓品种。

图3 18种蓝莓粗提液还原能力的测定Fig.3 The reducing power of eighteen cultivars of blueberry extracts

2.4 不同产区18种蓝莓总酚、黄酮及花青素含量

多酚、黄酮及花青素等生物活性物质具有抗氧化、抗炎症以及抗癌等功能,对维持和促进人体健康有积极作用。有研究[19]表明蓝莓总抗氧化能力与总酚含量具有良好的线性关系。由表2中可以看出,不同产区不同品种蓝莓中的总酚、黄酮及花青素含量存在差异。总酚含量的范围为0.63～2.81mg/g,含量最高的为杭州的森吐里昂,含量最低的为青岛的尼尔森,含量较高的还有杭州的杰兔、园蓝、巨丰等。黄酮含量在0.05～0.20mg/g之间,含量最高的为杭州的园蓝及青岛的尼尔森,含量最低的为杭州的梯芙蓝和杰兔。花青素含量在0.06～0.68mg/g之间,杭州的森吐里昂花青素含量最高,为0.68mg/g,含量最低的为上海的灿烂。

2.5 蓝莓粗提液对副溶血性弧菌的抑制作用

由表3可以看出,不同产区不同品种蓝莓提取物对副溶血性弧菌均有一定的抑制作用,但抑制程度存在差异。其中抑菌效果表现突出的有杭州的粉蓝、顶峰以及上海的粉蓝、H31,它们对副溶血性弧菌的MIC值仅为15.625mg/mL。Vivian C.H.Wu等[20]通过研究表明美国越橘中酚醛、花青素和有机酸等成分对大肠杆菌O157∶H7均有抑制作用,且酚类物质的抑菌效果最好。Saftner等[21]的研究表明蓝莓所表现出的良好品质与蓝莓生长的地理位置、气候条件以及蓝莓本身的基因型有关。本文中的蓝莓产于我国三个不同的地区,由于其地理位置及气候的不同很可能导致蓝莓中所含活性成分不同,例如对抑菌作用贡献较大的酚类物质含量的不同,这就导致了18种不同蓝莓粗提取液对副溶血性弧菌的抑制作用产生差异。

表2 18种蓝莓总酚、黄酮及花青素的含量Table 2 The total phenolics content,total flavonoids and total anthocyanins contents of 18 blueberry cultivars

表3 18种蓝莓粗提液对副溶血性弧菌的MIC值和MBC值Table 3 The MIC and MBC of 18 blueberry extracts against Vibrio parahaemolyticus

3 结论

不同产区不同品种的蓝莓有不同的抗氧化活性,对DPPH自由基、羟基自由基表现出不同的清除能力,其中DPPH自由基清除率在11%～65%之间,羟基自由基清除率在20%～64%之间。DPPH自由基清除能力最强的为杭州的森吐里昂,清除率为65.06%±0.04%,清除OH自由基能力最强的为青岛的爱国者,清除率为64.4%±0.02%。它们的还原能力也存在一定的差异,吸光度值在0.3～1.4之间,吸光度值越大,还原能力越强,还原能力最强的为杭州的森吐里昂。

不同产区18种蓝莓中总酚含量、黄酮含量及花青素含量存在差异,酚类物质含量较高的品种对应较强的抗氧化能力。

18种蓝莓粗提液对副溶血性弧菌的均有一定抑制作用,不同品种不同产区蓝莓对副溶血性弧菌均表现出了抑制作用,且它们的MIC和MBC值不相同,即抑制效果不同。对副溶血性弧菌抑制作用较强的有杭州的顶峰、粉蓝,MIC值仅为15.625mg/mL。

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Study on antioxidant capacities and antibacterial effects of eighteen blueberry cultivars from different areas

JIANG Wen-jie1,SUN Xiao-hong1，*,ZHU Ying1,YANG Han1,LIU Xiao-yu1,Vivian Chi-hua Wu2,PAN Ying-jie1

(1.College of Food Science & Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing & Preservation,Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Aquatic Products on Storage and Preservation(Shanghai),Ministry of Agriculture,Shanghai 201306,China;2.School of Food and Agriculture,the University of Maine,Orono,ME04469,USA)

The antioxidant capacities and antibacterial effects of 18 different blueberry cultivars from Hangzhou,Shanghai and Qingdao were investigated in this study. The antioxidant capacities of blueberry extracts were measured through free radical scavenging abilities including DPPH· and OH· free radicals and reducing power. The contents of total phenolics,flavonoids and anthocyanins were determined using Folin-Ciocalteu method,Sodium nitrite method and pH differential method respectively. The antibacterial effects of blueberry extracts against Vibrio parahaemolyticus were determined by the test tube two-fold dilution method. The results showed that 18 blueberry cultivars from three different areas showed good DPPH· and OH· free radical scavenging abilities with the range from 11%～65% and 20%～64%,respectively. The blueberry cultivars of Hangzhou showed stronger reducing power than those of the other two areas. 18 blueberry cultivars showed different antibacterial effects against Vibrio parahaemolyticus with the Minimal inhibitory concentration(MIC)and the Maximum inhibitory concentration(MBC)being of 15.625mg/mL and 250mg/mL,respectively. It can be concluded that there were differences in their function and components among different blueberry cultivars of different areas.

different areas;blueberry extracts;antioxidant capacities;antibacterial effects

2014-03-10

姜文洁(1989-)，女，硕士研究生，研究方向：食品科学与工程。

*通讯作者:孙晓红(1978-),女，博士，副教授，研究方向：食品安全与食品微生物。

上海市科委部分地方院校能力建设项目(11310501100)；上海市教育委员会科研创新项目(11YZ159)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)01-0119-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.017