COX－2在VEGF－C介导的人宫颈癌细胞生物学行为中的作用研究＊

石小燕， 毛晓露， 彭彩霞， 谭 露， 张亚东△

COX－2在VEGF－C介导的人宫颈癌细胞生物学行为中的作用研究＊

石小燕1， 毛晓露2， 彭彩霞1， 谭 露1， 张亚东1△

武汉市中心医院1中心实验室2临床检验科，武汉 430014

目的 检测血管内皮生长因子－C（VEGF－C）和环氧合酶－2（COX－2）在人宫颈癌细胞系中表达，探讨二者之间的关系及COX－2在VEGF－C介导的人宫颈癌细胞生物学行为中的作用。方法 用Western blot方法检测VEGF－C和COX－2在HeLa、Siha、C33a和Caski等4株宫颈癌细胞中的表达；用特定浓度的COX－2特异性抑制剂NS398处理HeLa细胞，评估其对HeLa细胞的增殖、转移产生的影响。结果 VEGF－C和COX－2蛋白在4株宫颈癌细胞中均有表达，且在不同细胞株中二者表达强弱一致。用NS398处理HeLa细胞后，其VEGF－C蛋白表达明显降低，且细胞凋亡率增加。NS398可诱导HeLa细胞增殖活性降低（P＜0.05），且呈剂量依赖模式。Transwell实验结果显示NS398处理组细胞侵袭力为（25.45±3.67）%，较对照组（40.38±0.72）%明显减弱（P＜0.05）。结论 VEGF－C和COX－2均在人宫颈癌细胞中表达，且COX－2与VEGF－C表达之间有一定的相关性。COX－2可能是宫颈癌细胞中VEGF－C表达的一个调节者，其抑制剂NS398对于VEGF－C介导的肿瘤生长和转移有一定抑制作用。

血管内皮生长因子－C； 环氧合酶－2； 人宫颈癌细胞系； 生物学行为

环氧合酶－2（cyclooxygenase－2，COX－2）是一种与慢性炎症相关的酶，在机体组织由慢性炎症进展到肿瘤的过程中起关键作用。COX－2能够介导细胞的多种生理功能，并通过影响细胞有丝分裂、细胞粘附和免疫监视等促进肿瘤发生、增殖及癌细胞播散。研究表明，COX－2过表达可用于预测包括宫颈癌在内的各种肿瘤细胞的侵袭力和转移潜能。人乳腺癌细胞中COX－2表达与生存下降、肿瘤体积增大、高分级、血管生成、淋巴结转移、远处器官转移等不良预后相关［1］。因此，COX－2过表达被认为是确定肿瘤进展和转移的主要标记物［2］。

最近，血管内皮生长因子家族的一个新成员血管内皮生长因子－C（vascular endothelial growthfactor－C，VEGF－C）已被证实在调节肿瘤生长和转移中扮演重要角色。研究揭示，VEGF－C表达可诱导肿瘤淋巴管生成，并与区域淋巴结转移和预后有关。新近研究发现人乳腺癌细胞VEGF－C表达与淋巴管生成、淋巴管浸润和淋巴结转移强烈相关［3］。现已观察到在许多人肿瘤细胞中COX－2和VEGFC表达呈有意义的正相关［3－6］，且肿瘤组织中VEGF－C的产生和淋巴管生成是COX－2过表达的直接后果［3］。文献报道，COX－2抑制剂etodolac可抑制在鼠macrophage－like RAW264.7细胞和肿瘤组织中VEGF－C mRNA的表达［7］。我们前期的研究结果表明COX－2可能是宫颈癌细胞中VEGF－C表达的一个调节者［4］。

本研究的主要目的是检测VEGF－C和COX－2在人宫颈癌细胞系中的表达情况，探讨二者之间的关系及COX－2在VEGF－C介导的人宫颈癌细胞生物学行为中的作用。

1 材料与方法

1.1 试剂

多克隆兔抗人VEGF－C（H－190）抗体购于Santa Cruz公司（Santa Cruz，Calif.）。多克隆兔抗人COX－2抗体及其特异性抑制剂NS398（70590）购于Cayman Chemical公司（Ann Arbor，MI，USA）。24孔Transwell和孔径为8μm的聚碳酸滤膜购于Costar UK，Ltd.（High Wycombe，UK）。基质胶购于BD Biosciences（Bedford，MA）。

1.2 细胞培养及处理

首先检测4株宫颈癌细胞HeLa、Siha、C33a和Caski（均购于ATCC，Manassas，VA）中VEGF－C和COX－2的表达情况，然后选择HeLa细胞进行下一步实验。细胞培养:细胞置于含10%FBS，50U／mL青霉素和50U／mL链霉素的RPMI 1640培养液中，在37℃5%CO2培养箱中孵育。处理:待细胞生长接近80%～90%融合时，更换培养液为不含血清的RPMI 1640新鲜培养液并加入COX－2特异性抑制剂NS398处理细胞，培养液中NS398的作用浓度分别为30、60和90μg／mL。继续培养24～48 h后，收获细胞备用。以未加入NS398且不含血清的RPMI 1640培养液培养24h的细胞作为对照。

1.3 Western blot检测细胞内VEGF－C和COX－2蛋白水平

按常规方法提取细胞总蛋白，以β－actin水平作为等量蛋白质上样对照。取50μg蛋白质样品进行SDS－PAGE电泳，采用半干电转移仪将蛋白质转至硝酸纤维素膜上；室温封闭2h后，用含0.05% Tween20的TBS缓冲液（TBST）漂洗3次，每次10 min；分别加入VEGF－C和COX－2抗体（1∶500），4℃孵育过夜，TBST漂洗3次后加入相应的辣根过氧化物标记的二抗（1∶5 000），37℃摇床温育2h，最后经ECL系统曝光显影，凝胶分析系统分析蛋白表达。

1.4 MTT比色法测定细胞增殖活性

应用非放射性细胞增殖检测系统测定细胞的增殖活性（MTT比色法）。收获对数生长期的培养细胞，将其重悬于含10%FBS的RPMI 1640培养液中制成单细胞悬液，调整细胞密度，以5×103／孔、体积100μL接种于96孔板，置于37℃、5%CO2培养箱培养4h或直至贴壁；接着细胞在体积100μL、含不同浓度NS398的无血清RPMI 1640培养液中培养，并置于37℃孵育。每一浓度设3个复孔，并设不加药物和不加细胞的对照组，置培养箱分别作用24和48h；24或48h后每孔加5mg／mL MTT溶液10μL继续培养4h，弃上清，每孔加入150μL DMSO，水平摇床混匀，酶标仪上测定570nm波长的吸光度（A）值，计算细胞增殖率（%）＝实验孔A／对照孔A×100%，并绘制浓度效应曲线。

1.5 流式细胞仪测定细胞凋亡率

处理24h后消化细胞，1 000r／min离心5min去除培养液，PBS洗2次，弃上清，收集细胞。加入含有10μg／mL PI和0.1%RNase A的PBS液200 μL重悬细胞，室温避光染色30min。应用流式细胞仪（FACS Calibur，Becton－Dickinson公司）检测细胞凋亡率，Cell Quest软件分析，每份标本分析≥10000个肿瘤细胞。

1.6 细胞体外侵袭能力的检测

细胞体外侵袭能力用24孔侵袭小室（Transwell）评估。HeLa细胞在含NS398（60μg／mL，依据MTT实验结果）的无血清RPMI 1640培养液中处理24h，以未经处理的细胞作对照。下室加满NIH3T3细胞培养的上清液作趋化因子；依次将插件盘各组件（橡胶垫、滤膜、上底板）盖在下室孔的上方并固定；向上室加入细胞悬液2.5×104／孔；侵袭小室于37℃、5%CO2培养箱中培养8h；取出膜用棉签轻轻拭去滤膜上表面未迁移细胞，70%甲醇室温固定45min，苏木精染色；高倍镜下每孔计数5个视野中的穿膜细胞数，计算穿膜细胞百分率。实验重复3次。

1.7 统计学分析

计量资料两组间比较采用配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析，细胞增殖活性与NS398剂量之间的相关性分析应用Pearson相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Western blot检测人宫颈癌细胞VEGF－C和COX－2的表达变化

VEGF－C和COX－2在4株人宫颈癌细胞中均有表达，HeLa细胞的VEGF－C蛋白表达最强，Caski细胞的VEGF－C蛋白表达最弱，COX－2在不同细胞株中的表达强弱与VEGF－C一致，见图1。当用COX－2的特异性抑制剂NS398处理宫颈癌HeLa细胞后，HeLa细胞中VEGF－C表达明显降低，见图2。

图1 VEGF－C和COX－2在4株人宫颈癌细胞中的表达Fig.1 Expressions of VEGF－C and COX－2in four human cervical cancer cell lines

图2 NS398处理前后HeLa细胞中VEGF－C的表达Fig.2 Expression of VEGF－C in HeLa cells before and after treatment with NS398

2.2 细胞增殖活性的检测

本研究中，我们选择HeLa细胞检测COX－2特异性抑制剂NS398是否影响人宫颈癌细胞的增殖活性。HeLa细胞孵育在含有不同浓度的NS398培养液中，24h后HeLa细胞的增殖活性没有明显的变化，48h后HeLa细胞增殖活性下降，且呈剂量依赖模式（r＝－0.968，P＜0.01），NS398作用的最佳浓度是60μg／mL，见图3。

2.3 细胞凋亡率的变化

用流式细胞仪测定COX－2特异性抑制剂NS398处理宫颈癌HeLa细胞24h后细胞凋亡率的变化，NS398处理后HeLa细胞的凋亡率达（26.10±1.10）%，与对照组的凋亡率（6.02± 0.96）%比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见图4。

2.4 细胞侵袭力的检测

Transwell实验结果显示，经NS398处理的细胞其穿透人工基底膜的能力（25.45±3.67）%，较未经处理的对照组（40.38±0.72）%明显减弱（P＜0.05），见图5。

图3 不同浓度NS398处理48h后HeLa细胞增殖活性的变化Fig.3 Changes of proliferation of HeLa cells treated with NS398 at different concentrations for 48h

图4 NS398处理前后HeLa细胞凋亡率的变化Fig.4 Changes of the apoptosis rate of HeLa cells before and after treatment with NS398

图5 NS398处理前后HeLa细胞侵袭力的变化Fig.5 Changes of invasive ability of HeLa cells before and after treatment with NS398

3 讨论

COX－2表达于多种肿瘤组织中并在肿瘤发生中起重要作用，研究表明COX－2过表达与肿瘤细胞增殖、迁移等临床进展和不良预后相关［8］。VEGFC已在多种人类肿瘤中检测到，其表达水平与淋巴结转移相关［5，9－10］。有证据显示VEGF－C是淋巴管生成的一个重要旁分泌因子，它的2个等位基因对于正常淋巴管的维持是必需的。临床和实验研究结果也强烈提示了关于VEGF－C介导的淋巴管生成在人类癌细胞转移中的潜在作用，且研究表明血清VEGF－C表达水平是宫颈鳞癌的一个潜在和有用的生物学标记物［7，11］。最近有报道，在多种人类肿瘤中COX－2和VEGF－C表达呈有意义的正相关［3，6］。我们前期的研究已证实VEGF－C蛋白具有促进肿瘤细胞侵袭和增殖的作用，且在宫颈癌组织和细胞中，COX－2和VEGF－C表达之间存在一定的相关性［4－5］。本研究中，我们首先用Western blot方法检测VEGF－C和COX－2在人宫颈癌细胞中的表达情况，发现二者在4株人宫颈癌细胞中均有表达，而且COX－2在不同细胞株中的表达强弱与VEGF－C的表达是一致的，这进一步说明COX－2和VEGF－C表达之间存在相关性。Timoshenko等［12］研究揭示COX－2可通过EP1和EP4受体增加VEGF－C的表达。而COX－2抑制剂etodolac干预之后，增加的VEGF－C表达被降调［7］。在宫颈癌的研究中，人们发现siRNA介导的COX－2表达抑制可降调VEGF－C表达［13］。本实验中，我们用COX－2特异性抑制剂NS398处理宫颈癌细胞后检测是否VEGF－C表达发生改变，结果VEGF－C蛋白表达水平较处理前明显降低。这说明COX－2对人宫颈癌细胞中VEGF－C表达具有调节作用。

研究表明COX－2参与了多数肿瘤细胞的增殖、血管生成及抗凋亡作用［14］。COX－2过表达可通过妨碍细胞的抗凋亡作用而促进肿瘤生长。选择性COX－2抑制剂可能通过降低PGE2水平、促进凋亡、改变细胞周期、抑制DNA损伤的修复、抑制血管生成来抑制肿瘤生长，增强化疗药的细胞毒性和肿瘤的放射敏感性。因此，COX－2被认为是化疗防治癌症的主要靶分子，检测COX－2基因或使用COX－2选择性抑制剂可抑制肿瘤生长和发生。Lee等［15］揭示COX－2表达可促进宫颈腺癌细胞增殖并通过增加血管生成而促进宫颈腺癌的进展。以往的研究显示，细胞被COX－2选择性抑制剂作用后，抗凋亡蛋白因子Bcl－2、Bcl－xL、Mcl－1、Survivin表达降低，而凋亡蛋白因子Bad表达升高，此外还认为COX－2选择性抑制剂诱导细胞凋亡可能与调节p53、Caspase－3、NF－κB等有关［16－17］。本研究中，我们用流式细胞仪测定COX－2特异性抑制剂NS398处理宫颈癌HeLa细胞24h后细胞凋亡率的变化，结果HeLa细胞的凋亡率明显增加，与对照组比较差异具有统计学意义。研究表明，对COX－2表达的抑制可以明显抑制细胞的增殖能力，用RNAi抑制COX－2表达后细胞生长受抑制可能与ku70、ku80表达被抑制有关。本研究发现在体外用NS398孵育HeLa细胞后，HeLa细胞的侵袭能力和增殖活性均明显下降，且增殖活性的下降呈剂量依赖模式。表明COX－2和VEGF－C在调节肿瘤生长和转移中扮演重要角色，同时也间接说明COX－2对肿瘤细胞具有促进生长、促进转移和抑制凋亡的作用，而COX－2对肿瘤细胞的这些作用很可能是通过其下游的靶基因VEGF－C得以实现的。

总之，本研究中宫颈癌HeLa细胞的几种生物学行为如侵袭力、增殖活性和VEGF－C表达水平在用COX－2特异性抑制剂NS398处理后均明显降低，而细胞凋亡率增加，这表明COX－2和VEGF－C在调节肿瘤生长和转移中扮演重要角色，且COX－2对宫颈癌细胞中VEGF－C的表达具有调节作用。此外，我们的研究也提供了一个可能的治疗方法，即通过应用COX－2特异性抑制剂抑制VEGF－C介导的肿瘤生长和转移。

［1］ Zhang X H，Huang D P，Guo G L，et al.Coexpression of VEGF－C and COX－2and its association with lymphangiogenesis in human breast cancer［J］.BMC Cancer，2008，8:4.

［2］ Wang M T，Honn K V，Nie D.Cyclooxygenases，prostanoids，and tumor progression［J］.Cancer Metastasis Rev，2007，26（3）:525－534.

［3］ Xin X，Majumder M，Girish G V，et al.Targeting COX－2and EP4to control tumor growth，angiogenesis，lymphangiogenesis and metastasis to the lungs and lymph nodes in a breast cancer model［J］.Lab Invest，2012，92（8）:1115－1128.

［4］ Shi X，Chen G，Xing H，et al.VEGF－C，VEGFR－3and COX－2 enhances growth and metastasis of human cervical carcinoma cell lines in vitro［J］.Oncol Rep，2007，18（1）:241－247.

［5］ Shi X Y，Xi L，Weng D H，et al.Clinicopathological significance of VEGF－C，VEGFR－3and cyclooxygenase－2in earlystage cervical cancer［J］.IJBS，2008，4（1）:58－63.

［6］ Morita Y，Morita N，Hata K J，et al.Cyclooxygenase－2expression is associated with vascular endothelial growth factor－C and lymphnode metastasis in human oral tongue cancer［J］.Original Article，2014，117（4）:502－510.

［7］ Iwata C，Kano M R，Komuro A，et al.Inhibition of cyclooxygenase－2 suppresses lymph node metastasis via reduction of lymphangiogenesis［J］.Cancer Res，2007，67（21）:10181－10189.

［8］ Hollingshead H E，Borland M G，Billin A N，et al.Ligand activation of peroxisome proliferator－activated receptor－beta／delta（PPARbeta／delta）and inhibition of cyclooxygenase 2（COX－2）attenuate colon carcinogenesis through independent signaling mechanisms［J］.Carcinogenesis，2008，29（1），169－176.

［9］ Gou H F，Chen X C，Zhu J，et al.Expressions of COX－2and VEGF－C in gastric cancer:correlations with lymphangiogenesis and prognostic implications［J］.J Exp Clin Cancer Res，2011，30（2）:14－21.

［10］ Wakisaka N，Hirota K，Kondo S，et al.Induction of lymphangiogenesis through vascular endothelial growth factor－C／vascular endothelial growth factor receptor 3axis and its correlation with lymph node metastasis in nasopharyngeal carcinoma［J］.Oral Oncol，2012，48（8）:703－708.

［11］ Mitsuhashi A，Suzuka K，Yamazawa K，et al.Serum vascular endothelial growth factor（VEGF）and VEGF－C levels as tumor markers in patients with cervical carcinoma［J］.Cancer，2005，103（4）:724－730.

［12］ Timoshenko A V，Chakraborty C，Wagner G F，et al.COX－2－mediated stimulation of the lymphangiogenic factor VEGF－C in human breast cancer［J］.Br J Cancer，2006，94（8）:1154－1163.

［13］ Liu H D，Xiao J B，Yang Y M，et al.COX－2expression is correlated with VEGF－C，lymphangiogenesis and lymph node metastasis in human cervical cancer［J］.Microvasc Res，2011，82（2）:131－140.

［14］ Hua K T，Lee W J，Yang S F，et al.Vascular endothelial growth factor－C modulates proliferation and chemoresistance in acute myeloid leukemic cells through an endothelin－1dependent induction of cyclooxygenase－2［J］.Biochimicaet Biophysica Acta，2014，1843（2）:387－397.

［15］ Lee J S，Choi Y D，Lee J H，et al.Expression of cyclooxygenase－2in adenocarcinomas of the uterine cervix and its relation to angiogenesis and tumor growth［J］.Gynecol Oncol，2004，95（3）:523－529.

［16］ 单萍，康慧聪，张继龙，等.塞来昔布对戊四氮点燃腺苷A1受体敲除小鼠癫痫发作及PGP、COX－2表达的影响［J］.华中科技大学学报:医学版，2014，43（5）:494－500，527.

［17］ 冯振中，武世伍，李楠，等.COX－2选择性抑制剂塞来昔布联合PPAR－γ配体罗格列酮治疗子宫内膜癌的实验研究［J］.华中科技大学学报:医学版，2014，43（6）:619－625.

（2014－11－02 收稿）

Role of COX－2 in the VEGF－C Mediated Biological Behaviors of Human Cervical Cancer Cells

Shi Xiaoyan1，Mao Xiaolu2，Peng Caixia1et al
1Department of Central Laboratory，2Department of Clinical Laboratory，The Central Hospital of Wuhan，Wuhan 430014，China

ObjectiveTo investigate the expressions of COX－2and VEGF－C，and their relationship in human cervical cancer，and to examine the role of COX－2in the VEGF－C mediated biological behaviors of human cervical cancer cells.Methods The expressions of COX－2and VEGF－C were detected in four human cervical cancer cell lines，HeLa，Siha，C33aand Caski，by Western blot.The effects of COX－2specific inhibitor NS398on the proliferation，apoptosis and migration of HeLa cells was evaluated after treatment with NS398.Results Both COX－2and VEGF－C were expressed in the four human cervical carcinoma cell lines and the expression levels of COX－2were coincident with those of VEGF－C in different cell lines.The expression of VEGF－C protein was significantly decreased and the apoptosis increased in HeLa cells treated with NS398.NS398profoundly suppressed the proliferation of HeLa cells in a dose－dependent manner（P＜0.05）.Transwell assay showed that the invasive ability was attenuated in NS398－treated cells as compared with control cells［（25.45±3.67）%vs.（40.38±0.72）%，P＜0.05］.Conclusion Both VEGF－C and COX－2are expressed in human cervical cancer cells and there is an association between the expressions of COX－2and VEGF－C.COX－2may be a regulator of VEGF－C and its specific inhibitor NS398may inhibit VEGF－C mediated tumor growth and metastases in human cervical cancer.

vascular endothelial growth factor－C； cyclooxygenase－2； human cervical cancer cell line； biological behavior

R737.33

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.02.010

＊湖北省自然科学基金资助项目（No.2013CFA060）；武汉市科技局资助项目（No.2014070504020245）

石小燕，女，1970年生，副主任医师，副教授，医学博士，E－mail:sxy＿70＠sina.com

△通讯作者，Corresponding author，E－mail:yadong－zhang＠hotmail.com