层层自组装血管内皮生长因子／磺化壳聚糖改性钛表面的研究＊

汪 洋， 刘小斌， 叶 巍， 梅 黎， 魏战杰， 张凯伦

层层自组装血管内皮生长因子／磺化壳聚糖改性钛表面的研究＊

汪 洋＃， 刘小斌＃， 叶 巍， 梅 黎， 魏战杰， 张凯伦△

华中科技大学同济医学院附属协和医院心血管外科，武汉 430022

目的 利用层层自组装技术，在钛金属表面构建血管内皮生长因子／磺化壳聚糖（VEGF／SCS）多层膜，评价其体外血液相容性，并探讨其在医用金属表面改性方面的应用前景。方法 采用化学合成制备磺化壳聚糖（sulfated chitosan，SCS）并对其表征进行分析；利用层层自组装技术在钛表面构建VEGF／SCS多层膜；对钛表面涂层进行表征分析并评价其体外血液相容性。结果 钛－VEGF／SCS自组装多层膜表面光整，该涂层体外溶血率为0.567%，可延长部分活化凝血酶原时间（APTT）至（49.29±1.05）s，减少血小板粘附和激活。结论 VEGF／SCS层层自组装形成的多层膜可以提高钛合金的体外血液相容性，显示其在医用金属表面改性方面的应用前景。

钛； 磺化壳聚糖； 自组装； 血液相容性

近年来，由于钛及其合金具有良好的机械性能和生物相容性，被广泛用于血液接触材料，包括心脏瓣膜、血流泵、心室辅助装置及血管内支架等［1］。然而，钛及其合金与血液接触过程中形成血栓依旧是一个亟待解决的问题。钛及其合金表面改性作为一种可行的方式正受到广泛的研究。

壳聚糖（chitosan，CS）是天然多糖，化学名为聚（1，4）－2－氨基－2－脱氧－β－D－葡聚糖，以β－1，4糖苷键连接N－乙酰－D－葡萄糖胺单元构成，在自然界中含量丰富。壳聚糖分子中含有较高比例的羟基（—OH）和氨基（—NH2），可通过多种化学修饰得到不同结构和功能的衍生物。其中，磺化壳聚糖（sulfated chitosan，SCS）具有类似肝素的化学结构、潜在的抗凝血活性［2］和对生物活性因子的保护作用［3］。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作为血管生成的重要因子之一，在血管内皮细胞的增殖、分化、迁移中起着重要的作用［4］。

层层自组装技术是在带有电荷的基材表面交替吸附聚阳离子物质和聚阴离子物质，可形成多层膜结构［5］，该技术方便易得，应用广泛。本研究通过层层自组装技术在钛合金表面构建VEGF／SCS多层膜，制备同时具有抗凝和趋化诱导作用的生物界面，并对其进行表征分析，评价其血液相容性。

1 材料与方法

1.1 SCS的制备与表征

取5mL氯磺酸（AR，上海金山亭新化工试剂厂），在冰水浴条件下，加入到20mL N，N－二甲基甲酰胺（DMF，AR，国药）中，搅拌后制得磺化试剂；将1.5g壳聚糖（Sigma－Aldrich）加入到60mL DMF中，再加入2mL二氯乙酸（AR，国药），充分搅拌后制得壳聚糖悬液；60℃条件下，将磺化试剂缓慢加入到壳聚糖悬液中，反应1.5h；向反应液中加入大量无水乙醇，收集沉淀，反复无水乙醇冲洗后，重新溶于双蒸水中；透析、冻干，制得磺化壳聚糖粉末。通过傅里叶变换显微红外光谱仪（VERTEX 70）检测其化学组成，元素分析仪（Vario ELⅢCHNSO）检测含硫量。

1.2 钛表面层层自组装VEGF／SCS多层膜与表征

①钛表面预处理。钛片（5mm×5mm，合肥沙泰机械）经金相砂纸逐级打磨后，依次丙酮、无水乙醇、双蒸水超声清洗15min。再将已清洗的钛片浸没在5mol／L NaOH溶液中，60℃水浴24h，然后在去离子水中80℃水浴8h，冲洗后室温下氮气吹干（Ti－OH）备用。②自组装多层膜的制备。将吹干后的钛片浸于多聚赖氨酸（1mg／mL）的PBS溶液中24h，清洗后氮气吹干。此时试件表面带正电荷，标记为Ti－PLL。配制pH 6.0、5mg／mL的SCS溶液和pH7.4、含1μg／mL VEGF165（PEPROTCH，美国）的PBS溶液（0.1mol／L的NaOH和1%乙酸调节pH）。将Ti－PLL浸入VEGF165溶液12h，取出后去离子水冲洗，收集清洗液，试件氮气吹干；再浸入SCS溶液20min，取出后去离子水冲洗，氮气吹干。重复以上过程10次，得到Ti－（VEGF／SCS）10多层膜。③分别使用接触角测量仪（JC2000C1）、环境扫描电子显微镜（Quanta 200）和ELISA试剂盒检测试件表面水接触角、表面形态及表面VEGF165含量。

1.3 钛－VEGF／SCS多层膜的体外血液相容性试验

1.3.1 溶血试验 采集健康成人血液9mL，按比例9∶1加入1mL 3.8%的枸橼酸钠抗凝剂。再按比例1∶1.25加入生理盐水12.5mL，置于清洁试管中待用。取待测试件用去离子水反复冲洗后加入10mL生理盐水，37℃孵育30min。孵育后每试件加入待用稀释血200μL，轻轻混匀，37℃孵育60 min后取出试件，将液体移入离心管中1 000r／min离心5min。离心完成后取上清液200μL加入96孔板中，用酶标仪（SUNRISE）测定A545nm值。同时，设置阴性对照组:取待用稀释血200μL加入10 mL生理盐水；阳性对照组:取待用稀释血200μL加入10mL蒸馏水，条件与测定方法同实验组。溶血率计算公式:溶血率（%）＝（实验组A545nm－阴性对照组A545nm）／（阳性对照组A545nm－阴性对照A545nm）×100%［6］。

1.3.2 活化部分凝血活酶时间（APTT）及凝血酶原时间（PT） 采集健康成人血液9mL，按比例9∶1加入1mL 3.8%的枸橼酸钠抗凝剂，置于清洁试管中待用。分别加入2mL全血与待测试件表面完全接触，在37℃孵育30min，采用自动化学发光免疫分析仪（ACS－180plus）测定凝血酶原时间（PT）和部分凝血酶原时间（APTT）。

1.3.3 血小板粘附试验 采集健康成人血液9 mL，按比例9∶1加入1mL 3.8%的枸橼酸钠抗凝剂，移入离心管中离心10min（4℃，1 000r／min），转移富含血小板的血浆（platelet－rich plasma，PRP）至EP管待用。在待测试件表面滴加150μL的PRP，用EP管封闭（12mm内径）使得每个样品表面均等地暴露于PRP，置入37℃恒温孵育箱中孵育30min后，取出试件用生理盐水反复冲洗，去掉试件表面松散粘附的血小板，经2.5%戊二醛溶液在室温下固定2h，再分别通过25%、50%、75%以及无水乙醇梯度脱水干燥，最后喷金于扫描电镜下观察。

1.4 统计学分析数据采用SPSS 19.0统计软件包进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（）表示，组间均数比较采用单因素方差分析（one－way ANOVA），以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 磺化壳聚糖的表征分析

通过傅里叶红外光谱来分析合成的磺化壳聚糖化学组成，图1所示磺化壳聚糖与壳聚糖在2 000～500cm－1的傅里叶红外光谱图。CS在1 645与 1 602cm－1、SCS在1 365与1 532cm－1处均出现壳聚糖典型的酰胺谱带。SCS的红外光谱中出现1 259和813cm－12个峰，其中1 259cm－1峰表示硫酸酯中O—S—O键的伸缩振动，813cm－1处峰代表C—O—S键的伸缩振动，由此可确定合成的SCS中存在硫酸酯结构。元素分析仪检测合成的SCS含硫量为6.7%。

2.2 钛表面VEGF／SCS多层膜的表征分析

①ELISA Kit检测剩余VEGF165溶液及已收集清洗液中VEGF165含量，以配置的VEGF165总量相减，计算试件表面VEGF165含量［7］。检测结果显示钛表面VEGF含量为（29.0±2.7）ng／cm2。

②接触角测量结果示，PLL涂层的Ti组较裸Ti组表面水接触角下降［（52.83±1.79）°vs.（60.17 ±1.52）°］，差异有统计学意义（P＜0.05）；多层膜改性的Ti组［（43.16±1.55）°］较Ti－PLL组进一步下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果表明经表面改性后的钛合金由于表面含有大量亲水性基团，如羟基、羧基等，使得接触角逐渐变小，亲水性增强。

③环境扫描电镜结果如图2所示，裸钛（图2A）经过金相砂纸逐级打磨及清洗后，表面较为平整，仅有微小不规则凸起；经NaOH处理过的钛片（图2B）表面呈现疏松网状结构，形状均一；自组装多层膜改性的钛片（图2C）表面虽仍可见孔隙，但较Ti－OH表面明显光整。

图1 样品的傅里叶红外光谱图Fig.1 Fourier transform infrared（FTIR）spectra of samples

图2 环境扫描电镜下观察样品表面Fig.2 Observation of the surfaces of samples under the environmental scanning electron microscope

2.3 钛－VEGF／SCS多层膜的体外血液相容性试验

2.3.1 溶血试验 溶血是因为过度的外界化学或机械张力致使红细胞膜破裂、溶解，并引起血红蛋白的释出。表1结果显示，血液与Ti－（VEGF／SCS）10聚电解质多层膜孵育后测得溶血率为0.567%，为高度血液相容［8］，显著低于Ti组（5.942%）和Ti－OH组（6.554%），差异有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 溶血试验结果（，n＝10）Table 1 The results of hemolysis test（，n＝10）

表1 溶血试验结果（，n＝10）Table 1 The results of hemolysis test（，n＝10）

组别A545nm值溶血率（%）0.035 1±0.002 1－阳性对照0.476 0±0.008 1－Ti 0.061 3±0.001 1 5.942 Ti－OH 0.064 0±0.001 4 6.554 Ti－（VEGF／SCS）10阴性对照0.037 6±0.001 1 0.567

2.3.2 活化部分凝血活酶时间（APTT）及凝血酶原时间（PT） PT和APTT分别用来检测外源性和内源性凝血系统活化的敏感指标。经统计分析，各实验组与正常血浆的PT值差异无统计学意义（P＞0.05）；Ti组、Ti－PLL组与正常血浆的APTT值差异亦无统计学意义（均P＞0.05），Ti－（VEGF／SCS）10组APTT值为（49.29±1.05）s，与Ti组（39.33±0.99）s差异有统计学意义（P＜0.05）。这表明表面涂覆有VEGF／SCS多层膜的Ti试件具有抑制内源性凝血系统激活的功能。

2.3.3 血小板粘附试验 血小板的粘附与激活是导致血液接触材料表面形成血栓的重要环节，因此，材料表面血小板粘附是评价医用材料血液相容性的另一个重要指标［9］。图3所示试件与PRP后表面粘附血小板的环境扫描电镜照片，可见裸钛（图3A）表面粘附大量的血小板，相互聚集；NaOH预处理的钛合金（图3B）表面仍然粘附有较多的血小板，也可以看到聚集现象，并且有较多“伪足”；Ti－VEGF／SCS聚电解质多层膜（图3C）的表面血小板粘附数量明显变少。这说明Ti－VEGF／SCS聚电解质多层膜可以减少血小板的粘附与激活。

图3 环境扫描电镜下材料表面吸附血小板形貌Fig.3 Observation of adherent platelets on the surfaces of samples under the environmental scanning electron microscope

3 讨论

钛及其合金的优异性能使其在生物医用装置领域得到广泛应用，但是仍不能满足全部的临床需要。缺乏良好的血液相容性使其应用在血液接触材料上具有潜在的致血栓和栓塞的风险，长期服用抗凝药物亦具有潜在的出血风险。钛及其合金与血液接触形成血栓，本质上是金属表面与血液接触时的相互作用。目前，改性钛及其合金表面使其具有生物学效应是目前研究的热点之一。壳聚糖作为一种天然的大分子物质，含有较多的羟基（—OH）和氨基（—NH2），有较好的生物相容性和可降解性，化学性质活泼，适当条件下化学修饰，可以生成多种结构和功能的衍生物［10］。壳聚糖经过磺化修饰，不仅可表现出抗凝能力，还具有抗菌、抗病毒等多种功能［2］，在药物的装载和运输方面也被广泛的研究［11］。有研究表明，磺化壳聚糖的含硫量高低是决定其抗凝血能力的重要因素［12］。VEGF是机体分泌的由二硫键共价链接的二聚体同源糖蛋白，对内皮细胞分裂和趋化具有特异性。研究表明VEGF可促进血管发生［13］，在血管损伤模型中，VEGF可以促进血管发生以及再内皮化过程［14－16］。通过固定VEGF改性医用材料已经成为目前研究的一个热点［1719］。

我们首先合成磺化壳聚糖，红外光谱显示其带有硫酸酯结构，且有较高含硫量。再用NaOH处理钛表面，使钛表面带有负电荷，以带正电荷的聚赖氨酸吸附于钛表面构建基底层。通过层层自组装在表面交替吸附VEGF和SCS，构建钛表面多层膜结构。血液相容性检测表明VEGF／SCS多层膜结构相对于裸钛，具有更好的血液相容性，这对于钛合金装置在心血管领域中的应用有积极意义。本研究旨在钛表面构建抗凝和诱导趋化内皮细胞双重作用的多层膜，期望在表面SCS抗血栓形成的同时，通过诱导内皮细胞快速包覆于材料表面，达到长期抗凝、抗血栓形成的目的。但是，对于自组装后自组装多层膜体内和体外细胞相容性、VEGF生物活性大小，以及对Ti－VEGF／SCS多层膜在体内表现出抗凝并诱导内皮细胞趋化增殖双重能力的评价，均有待进一步探索。

［1］ Yu S，Yu Z T，Wang G，et al.Evaluation of Haemocompatibility of TLM titanium alloy with surface heparinization［J］.Rare Metal Eng，2009，38（3）:384－388.

［2］ Jayakumar R，Nwe N，Tokura S，et al.Sulfated chitin and chitosan as novel biomaterials［J］.Int J Biol Macromol，2007，40（3）:175－181.

［3］ 吴兴杰，马列，高长有.磺化壳聚糖的制备及其对生长因子活性的保护作用［J］.高分子学报，2012，（4）:418－426.

［4］ Soker S，Machado M，Atala A.Systems for therapeutic angiogenesis in tissue engineering［J］.World J Urol，2000，18（1）: 10－18.

［5］ Tsai C C，Chang Y，Sung H W，et al.Effects of heparin immobilization on the surface characteristics of a biological tissue fixed with a naturally occurring crosslinking agent（genipin）: an in vitro study［J］.Biomaterials，2001，22（6）:523－533.

［6］ 伏鹏，刘成珪，张凯伦.利用阴极电泳涂装技术提高钛合金血液相容性的研究［J］.华中科技大学学报:医学版，2011，40（4）:437－440.

［7］ Chen P R，Chen M H，Lin F H，et al.Release characteristics and bioactivity of gelatin－tricalcium phosphate membranes covalently immobilized with nerve growth factors［J］.Biomaterials，2005，26（33）:6579－6587.

［8］ 中华人民共和国国家标准医疗器械生物学评价第4部分:与血液相互作用试验选择［G］.GB／T 16886.4－2003／ISO 10993－5:1999.

［9］ Kim Y J，Kang I K，Huh M W，et al.Surface characterization and in vitro blood compatibility of poly（ethylene terephthalate）immobilized with insulin and／or heparin using plasma glow discharge［J］.Biomaterials，2000，21（2）:21－30.

［10］ Elsabee M Z，Morsi R E，AI－Sabagh A M.Surface active properties of chitosan and its derivatives［J］.Colloids Surf B Biointerfaces，2009，74（1）:1－16.

［11］ Saranya N，Moorthi A，Saravanan S，et al.Chitosan and its derivatives for gene delivery［J］.Int J Biol Macromol，2011，48（2）:234－238.

［12］ Drozd N N，Sher A I，Makarov V A，et al.Comparison of antithrombin activity of the polysulphate chitosan derivatives in vivo and in vitro system［J］.Thromb Res，2001，102（5）:445－455.

［13］ Pepper M S，Ferrara N，Orci L，et al.Potent synergism be－tween vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor in the induction of angiogenesis in vitro［J］.Biochem Biophys Res Commun，1992，189（2）:824－831.

［14］ Takeshita S，Zheng L P，Brogi E，et al.Therapeutic angiogenesis.A single intraarterial bolus of vascular endothelial growth factor augments revascularization in a rabbit ischemic hind limb model［J］.J Clin Invest，1994，93（2）:662－670.

［15］ Banai S，Jaklitsch M T，Shou M，et al.Angiogenic－induced enhancement of collateral blood flow to ischemic myocardium by vascular endothelial growth factor in dogs［J］.Circulation，1994，89（5）:2183－2189.

［16］ 郑凯，项帅，董汉华，等.大鼠食管静脉曲张模型中VEGF参与内皮祖细胞的调控［J］.华中科技大学学报:医学版，2014，43（6）:636－638.

［17］ Poh C K，Shi Z，Lim T Y，et al.The effect of VEGF functionalization of titanium on endothelial cells in vitro［J］.Biomaterials，2010，31（7）:1578－1585.

［18］ Singh S，Wu B M，Dunn J C.Delivery of VEGF using collagen－coated polycaprolactone scaffolds stimulates angiogenesis［J］.J Biomed Mater Res A，2012，100（3）:720－727.

［19］ Zhang H，Jia X，Han F，et al.Dual－delivery of VEGF and PDGF by double－layered electrospun membranes for blood vessel regeneration［J］.Biomaterials，2013，34（9）:2202－2212.

（2014－11－25 收稿）

Surface Modification of Titanium with Vascular Endothelial Growth Factor／Sulfated Chitosan by Use of Layer－by－layer Self－assembling Technique

Wang Yang＃，Liu Xiaobin＃，Ye Wei et al
Department of Cardiovascular Surgery，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China

ObjectiveTo establish the multilayers of vascular endothelial growth factor／sulfated chitosan（VEGF／SCS）on the surface of titanium by layer－by－layer（LBL）self－assembling technique，and to explore the in vitro blood compatibility of this titanium and its application prospect in the area of medical metal surface modification.Methods Sulfated chitosan was prepared by chemical synthesis and its characteristics were analyzed.The VEGF／SCS multilayers were obtained by LBL self－assembling technique.The physical properties of the multilayers were analyzed.The blood compatibility of the films in vitro was evaluated.Results The surface of VEGF／SCS multilayers was smooth and uniform.The rate of hemolysis of VEGF／SCS multilayers was 0.567%，and VEGF／SCS multillayers could prolong APTT to（49.29±1.05）s，inhibit platelet adhesion and activation effectively.Conclusion The in vitro blood compatibility of titanium alloy can be improved significantly after being coated with VEGF／SCS multilayers，and this technology shows favorable prospects in the area of medical metal surface modification.

titanium； sulfated chitosan； self－assemble； blood compatibility

R318.11

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.02.003

＊湖北省自然科学基金资助项目（No.2013CFB166）

＃同为第一作者

汪 洋，男，1989年生，硕士研究生，E－mail:Jasonmasterwy＠163.com；刘小斌，男，1969年生，主任医师，教授，医学博士，E－mail: docterlxb＠sina.cn

△通讯作者，Corresponding author，E－mail:prozkl＠163.com