紫甘蓝花色苷组成及抗猪传染性胃肠炎病毒活性分析

雷用东,魏向利,罗小玲,*,童军茂,赵晓燕

(1.农业部食品质量监督检验测试中心,新疆石河子 832000；2.石河子大学食品学院,新疆石河子 832000；3.北京市农林科学院,北京 100097)

紫甘蓝花色苷组成及抗猪传染性胃肠炎病毒活性分析

雷用东1,魏向利1,罗小玲1,*,童军茂2,赵晓燕3

(1.农业部食品质量监督检验测试中心,新疆石河子 832000；2.石河子大学食品学院,新疆石河子 832000；3.北京市农林科学院,北京 100097)

为在体外探寻紫甘蓝花色苷(Anthocyanins from Purple Cabbage,APC)抗猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)的活性效果。本研究以APC粉为原料,采用高效液相色谱仪与质谱仪联机的方法鉴定其花色苷成分后,在体外将APC作用于感染TGEV的猪睾丸细胞系(swine testicle,ST)单层表面,通过研究APC对TGEV诱导ST细胞的形态学变化和细胞存活情况,评价APC是否具有抗TGEV的活性作用。结果表明:紫甘蓝花色苷粉中至少含13种花色苷成分,其中主要为矢车菊色素的糖苷；APC对细胞无毒性的最大安全质量浓度为100μg/mL；APC在安全浓度范围内能够显著抑制TGEV诱导的ST细胞形态变化,降低凋亡。因此,紫甘蓝花色苷具有抗TGEV的生物活性作用。

紫甘蓝花色苷,猪睾丸细胞系,猪传染性胃肠炎病毒,生物活性

紫甘蓝(Purple Cabbage),又称红甘蓝,拉丁名:BrassicaoleraceaL.var.capitataL.,十字花科芸苔属[1]。紫甘蓝作为一种食用性蔬菜,在我国已大面积种植,价格低廉、色素含量高,且安全无毒,具有特定的药理药效功能。研究发现花色苷具有抗氧化[2]、抗癌、抗肿瘤[3]、抑菌[4]等作用,在食品、医药以及化妆品有广泛的用途。TGEV为急性猪传染性胃肠炎病病毒,传染速度快,尤其仔猪容易受感染[5],已给养猪业造成了很大经济损失。因此,本项目在结合国内外对紫色作物花色苷抗氧化生理功能研究的基础上,以紫甘蓝花色苷粉末为材料,借助体外ST细胞为载体,通过APC对TGEV诱导的ST细胞存活率和细胞形态学变化,在体外开展其抗病毒活性的研究。为APC预防病毒药物的开发提供理论依据和预防家禽病毒提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

紫甘蓝花色苷粉 由北京农林科学院蔬菜研究中心提供；ST细胞及TGEV病毒 由北京市农林科学院畜牧所提供；胰蛋白酶 美国BD公司；胎牛血清(FBS),MEM培养基 Hyclone公司；二甲基亚砜(DMSO),噻唑蓝(MTT) Sigma公司；其余试剂 均为国产分析纯。

液质联用仪(HPLC 1200系列,MS 6310系列) Agilent公司；CO2水套式培养箱 Thermo公司；超净工作台SW-CJ-2FD 苏州安泰空气技术有限公司；倒置显微镜TE300 Nikon公司；细胞自动计数分析仪CYT-100 CYTORECON公司；酶标仪 550 Bio Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 紫甘蓝花色苷的主要成分分析 样品的制备:采用0.01mol/L磷酸盐缓冲液将APC粉配制成质量浓度为1mg/mL的母液,在无菌条件下,用0.22μm滤膜过滤备用。

HPLC-MS联机上机参数:流动相A采用5%甲酸水溶液,流动相B采用100%乙腈,梯度洗脱程序如下:0min(13%B,87%A)、8min(22%B,78%A)、15min(23%B,77%A)、20min(100%B)、25min(100%B)、26min(13%B,87%A)、33min(停止)。流速为0.8mL/min；柱温为25℃；进样量为10μL；检测波长为520nm。MS采用正离子模式,N2流速为12L/min,干燥气温度为350℃,喷雾器压力为45psig,离子扫描范围为100～1000m/z。

1.2.2 ST细胞的培养 从液氮罐中取出ST细胞,先将细胞移入含有20% FBS的MEM培养瓶中,置于37℃、5% CO2培养箱中进行复苏。培养约48h,细胞待长成单层,进行弃液,采用0.25%胰蛋白酶消化,加入含10% FBS的MEM培养液进行传代培养。

1.2.3 紫甘蓝花色苷对ST的毒性实验 为探索APC抗病毒作用,预先研究APC对ST细胞的毒性作用。取传代培养至3～5代的ST细胞,消化细胞并稀释浓度为2～3×105cells/mL的细胞悬液,采用移液排枪将细胞悬液加入96孔细胞培养板中,每孔移入量为200μL,置于37℃、5% CO2培养箱,待长成单层细胞,弃液,分别加入含不同体积的APC母液,使其APC质量浓度分别为20、40、60、80、100、120、140μg/mL,用含2% FBS 的MEM细胞维持液使其每孔总体积均为200μL。置于37℃、5% CO2培养箱培养,分别在48h和96h时采用MTT法测定OD490值,OD值的大小能反映出细胞存活情况。设置细胞对照和重复对照,三次重复实验。

1.2.4 紫甘蓝花色苷体外抗TGEV活性实验

1.2.4.1 紫甘蓝花色苷体外的预防病毒实验 按照上述APC对ST毒性实验方法,移取200μL的细胞悬液置于96孔细胞培养板,向每孔中加入不同体积APC母液,在37℃培养箱中孵育1h后,每孔移入20μL TGEV病毒液,孵育1h,弃液,换上新的细胞维持液,置于37℃、5% CO2培养箱培养。培养至48h和72h时,采用MTT法测定OD490值。同时实验设细胞和病毒对照,三次重复实验。

1.2.4.2 紫甘蓝花色苷体外的治疗病毒实验 取待长成单层细胞后的96孔细胞培养板,弃液,每孔移入20μL TGEV病毒液,37℃培养箱孵育1h,弃液,向每孔中加入不同体积APC母液,用细胞维持液补液体至200μL。置于37℃、5% CO2培养箱,培养至48h和72h时,采用MTT法测定OD490值,同时采用显微镜进行观察并记录细胞形态变化。实验对照同上。

1.3 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 紫甘蓝花色苷的成分分析

通过HPLC分析得到紫甘蓝花色苷的HPLC色谱图,见图1,图中明显有13个峰,说明紫甘蓝实验至少含13种花色苷组分,其中峰1、9、10的峰面积明显较大,说明此三种组分在总的花色苷含量比例较大。根据MS分析出的离子碎片信息,母离子及二级离子碎片信息的质核比,并结合HPLC的保留时间,参考其它文献[1,6],鉴定出13种紫甘蓝花色苷主要成分的结构,结果见表1。由表1可知,紫甘蓝花色苷组分均以矢车菊色素为苷元的多糖和不同酰基化结合的糖苷,与刘玉芹[7]鉴定紫甘蓝花色苷的九种组分大体相符合。本文从紫甘蓝样品中鉴定出13种不同酰基化结合的花色苷组分,主要是由于品种差异、提取条件及检测条件等差异引起的。

图1 紫甘蓝主要花色苷的HPLC色谱图(520nm)Fig.1 HPLC-MS profiles(520nm) of the major anthocyanins from purple cabbage

表1 紫甘蓝中主要的花色苷成分Table 1 The major anthocyanin components of purple cabbage

表2 APC对ST细胞毒性实验结果Table 2 The result of APC on cytotoxicity test of ST ±S,n=6)

2.2 紫甘蓝花色苷对ST细胞毒性的研究

本文ST细胞存活率采用经典MMT法[8],测定经不同质量浓度的APC处理ST单层细胞,在不同时间下测定其OD值,可OD值的高低间接反映出ST的生长情况。ST细胞在48h贴壁基本完成,在96h后,细胞因培养的营养物质耗尽、pH改变及代谢产物等因素,细胞开始慢慢衰老。因此,本文选定48h和96h时测定其OD值,结果见表2。

从表2看出,在48h和96h时,APC小于等于100μg/mL各处理组的OD值与空白对照组的OD值相当或稍高；当APC小于60μg/mL各处理组的OD值,随着浓度增加而对应的OD值随之升高,均比对照组的OD值较高,都能显著地促进了ST细胞的生长,说明APC小于100μg/mL对ST生长有利或者无细胞毒性作用；APC浓度大于100μg/mL各处理组,其OD值与细胞对照相比,呈下降趋势,并且差异显著(p<0.05),说明APC浓度高于100μg/mL 对ST生长受到不同程度毒害作用。APC在低浓度下,对ST细胞生长无毒性作用,但是浓度大于100μg/mL,对细胞生长不利。在48h时,140μg/mL高浓度的OD值为0.377,与对照OD值0.582相比,OD值降低了0.205,差异显著；同时在96h时,140μg/mL高浓度的OD值为0.702,对照组为0.926,OD值降低幅度到达0.224,由此说明APC对ST细胞生长无影响的最大安全浓度。本研究体外实验加入APC,对正常ST细胞生长无细胞毒性作用,APC浓度超过100μg/mL,各细胞组存活情况显著下降,提示100μg/mL是APC对ST细胞的最大安全浓度。APC是优良的天然抗氧化剂,徐亚民[9]等研究发现紫甘蓝花色苷具有抗氧化性,对细胞免疫系统具有调节作用,因此APC在一定浓度范围内可能增强了ST细胞机能,从而促进其生长。因此,通过细胞毒性实验得出100μg/mL是APC对ST单层细胞生长无副作用的最大安全浓度。

2.3 紫甘蓝花色苷体外抑制TGEV活性的研究

本文在100μg/mL APC的最大安全浓度范围下,从预防作用和治疗作用两方面来探讨APC抑制TGEV增殖的活性效果。向ST单层细胞预先加入APC于孵育后,再加入TGEV病毒孵育,即为APC体外的预防作用,而预先加入TGEV病毒孵育再接入APC,即为APC体外的治疗作用。图2显示,以正常ST细胞为对照,其存活率以100%计；在48h时,病毒组已出现严重病变,其ST细胞存活率约为20%；而接入不同浓度APC处理后的ST细胞存活率,预防作用和治疗作用的细胞存活率均比病毒组存活率高,并随着APC浓度增加而细胞存活率呈上升趋势,差异显著,尤其在APC浓度为100μg/mL预防作用的细胞存活率达到80%,治疗作用的细胞存活率接近70%,说明通过在体外接入不同浓度的APC对TGEV增殖起到抑制作用,一定时间内能减慢细胞的病变。从图2也可以看出,APC在同一浓度下,其预防作用明显比治疗作用的细胞存活率较高,提示通过预先接入APC能增强细胞的抵抗病毒的能力。由此,说明了与TGEV病毒对照组比较,在一定时间内,APC能保护ST的细胞正常机能,抑制TGEV增殖和延长ST细胞的脱落时间。

图2 不同浓度紫甘蓝花色苷体外抑制TGEV的作用(48h)Fig.2 Influence of prevention and treatment on TGEV under different concentration of APC(48h)

图3显示,在72h时,APC抗TGEV的活性作用。细胞生长至72h时,TGEV病毒组存活率基本趋近于零,而不同浓度APC处理组,其ST细胞存活率均显著高于病毒对照组,并呈剂量依赖关系,同时预防作用的细胞存活率比治疗作用较高,提示APC对TGEV的预防作用比治疗作用明显,这与紫甘薯花色苷抗TGEV效果一致[10]。当同一APC浓度为100μg/mL时,预防作用方面,72h的细胞存活率接近20%,而48h的存活率约为80%；治疗作用方面,72h的细胞存活率约15%,而48h的存活率约为70%,这一结果说明:APC相同浓度随着时间的推移,ST细胞存活率呈下降趋势,其抗TGEV增殖能力逐渐下降。各浓度APC处理对受TGEV病毒感染ST细胞的预防和治疗作用趋势一致,呈剂量依赖关系,由此显示了一定浓度的APC处理下,能明显抑制TGEV在ST细胞上的生长。研究表明,花色苷具有抗氧化作用[9],能降低细胞凋亡,由此推断APC可能通过提高机体抗氧化酶类活性,防止细胞膜磷酸化,减少自由基释放,能阻断细胞信号传导途径,从而起到减慢TGEV于ST细胞核内的增殖作用。因此,在饲养方面可以适当为畜禽补给紫甘蓝绿色蔬菜,能增强机体的抗病毒能力,提高其免疫能力,起到一定预防作用。

图3 不同浓度紫甘蓝花色苷体外抑制TGEV的作用(72h)Fig.3 Influence of prevention and treatment on TGEV under different concentration of APC(72h)

2.4 紫甘蓝花色苷与TGEV对ST细胞形态学的影响

细胞病变程度是反映药物抗病毒效果的经典指标。ST单层细胞受TGEV病毒感染后,单层细胞病变表现为形态改变、细胞脱落,而这一病变[11]在光学显微镜下可以观察到。图4A显示了正常ST单层细胞,呈长梭形,大小均匀；加入APC质量浓度为20μg/mL处理后(图4B),ST单层细胞形态与正常一致,无空隙,很少细胞脱离单层,不影响细胞生长；图4C为加入APC质量浓度为100μg/mL处理后ST细胞,细胞数量较图4A和4B相对较少,但不影响细胞形态。图4D显示ST细胞受TGEV病毒感染,单层细胞形态完全改变,大部分细胞脱离单层,发生严重的病变；APC 20μg/mL作用于TGEV诱导的ST细胞形态,有少量细胞存在,但细胞均肿大、细胞间隙大,如图4E显示。图4F显示APC100μg/mL作用于TGEV诱导的ST细胞形态,有部分细胞已脱离单层,细胞肿大,病变情况比图4D、图4E较好,说明APC较高浓度抗TGEV能力较强。从形态学方法得出,APC对TGEV病毒增殖有一定的抑制作用,一定时间内能保护ST的细胞形态。

图4 APC对ST细胞形态的影响(×100)Fig.4 Effect of APC on ST morphology under microscope(× 100)注:A:ST细胞对照;B:ST+APC 20μg/mL; C:ST+APC 100μg/mL;D:TGEV病毒对照; E:TGEV+APC 20μg/mL;F:TGEV+APC 100μg/mL。

3 结论

本研究鉴定了紫甘蓝含有13种不同花色苷,其中主要成分为矢车菊色素的葡萄糖苷；APC对ST生长无细胞毒性作用的最大安全质量浓度为100μg/mL；通过预防和治疗作用探讨,APC能够显著抑制TGEV诱导的ST细胞形态变化,且抑制程度成剂量关系,提高细胞存活率。因此,紫甘蓝花色苷具有抗病毒生物活性,在体外具有抗TGEV病毒功能,能对ST细胞起到保护作用。

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Analysis of the anthocyanin profiles andanti-TGEV activity from purple cabbage

LEI Yong-dong1,WEI Xiang-li1,LUO Xiao-ling1,*,TONG Jun-mao2,ZHAO Xiao-yan3

(1. Supervision and Testing Center for Food Quality Ministry of Agriculture,Shihezi 832000,China;2. College of Food,Shihezi University,Shihezi 832000,China;3. Beijing Academy of Agriculture and Forestry Science,Beijing 100097,China)

To explore the inhibitory action of anthocyanins from purple cabbage(APC)for transmissible gastroenteritis virus of swine(TGEV)invitro. APC powder as raw material,the sample of anthocyanins structure were identified by HPLC-MS method,APC were acted on disseminated TGEV in monolayer ST cells,then its influence on the morphological changes as well as cell survival were researched,it was evaluated whether APC had the active role of anti-TGEV. The results showed that the purple cabbage contained at least 13 kinds of anthocyanins,the main component was cyaniding-glucosides. The maximum safe mass concentration of APC was 100μg/mL for ST cells nontoxicity. Introduced TGEV to ST,APC could restrain ST cell morphological changes and less death rate under the 100μg/mL. In summary,anthocyanins from purple cabbage had significantly anti-TGEV biological activity.

Anthocyanins from purple cabbage;ST cell;TGEV;biological activity

2014-04-18

雷用东(1988-)，男，硕士，研究方向：果蔬贮藏与加工。

*通讯作者:罗小玲(1962-)，女，博士，研究员，研究方向：食品检测。

国家自然科学基金资助项目(30972048)。

TS201.4

A

1002-0306(2015)03-0095-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.011