补阳还五汤对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤保护作用研究

朱雪钦韩 静胡 娟，庞文生，3*

1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.福建中医药研究院，福建 福州 350003；3.福建省第二人民医院，福建 福州 350003

补阳还五汤对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤保护作用研究

朱雪钦1韩 静2胡 娟1，2庞文生1，3*

1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.福建中医药研究院，福建 福州 350003；3.福建省第二人民医院，福建 福州 350003

目的：探讨补阳还五汤对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法：采用线栓法制造大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，给药组给予补阳还五汤原方剂量的水煎液，每日一次，连续灌胃7d；模型组与假手术组均给予同体积生理盐水。测定SOD、GST和GSH－PX活性以及血清中MDA含量。结果：补阳还五汤可以显著提高脑缺血再灌注大鼠SOD、GST、GSH－PX的活性，明显抑制MDA的生成。结论：补阳还五汤对脑缺血再灌注损伤具有明显的保护作用，抗氧化作用是其发挥脑缺血保护作用的机制之一。

补阳还五汤；MCAO大鼠模型；SOD；GST；GSH－PX；MDA

补阳还五汤是中医益气活血法的经典方，由黄芪、当归尾、赤芍、地龙、川芎、桃仁、红花七味药组成。临床广泛用于缺血性脑血管疾病，对灌注的大鼠皮层及小脑中活性氧 （ROS）的生成、对大鼠血管源性脑水肿的抗应冠心病、心肌梗死及其他血栓栓塞性疾病均有作用［1］，可显著抑制脑缺血／再激具有治疗作用。大量研究显示，补阳还五汤对抗脑缺血所致的氧化应激损伤具有神经保护作用［2，3］。本文将采用线栓法制作大鼠脑缺血／再灌注（MCAO）模型，并通过测定SOD、GST和GSH－Px活性以及MDA的含量，着重观察补阳还五汤经典方在大鼠脑缺血／再灌注损伤中的抗氧化作用，为其临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠，体重250±20g，由福建医科大学动物实验中心提供。

1.2 实验仪器 VF3001全波长扫描多功能酶标仪（美国）。

1.3 药物与试剂 黄芪（批号：1203131，源和堂中药饮片有限责任公司）；当归尾（批号：1203046，源和堂中药饮片有限责任公司）；赤芍（批号：1203072，源和堂中药饮片有限责任公）；地龙（批号：1112207，源和堂中药饮片有限责任公司）；川芎（批号：1203055，源和堂中药饮片有限责任公司）；桃仁（批号：120201，源和堂中药饮片有限责任公司）；红花（批号：1203083，源和堂中药饮片有限责任公司）；氯化钠（批号：F20110307，国药集团化学试剂有限公司）；SOD、GSH－Px和MDA试剂盒（南京建成生物工程研究所）；GST试剂盒 （上海生工生物技术有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 动物模型制备 采取线栓法制作大脑中动脉闭塞／再灌注模型［4］。动物术前禁食12h，自由饮水。用10%水合氯醛3ml／kg行腹腔注射麻醉。钝性分离右侧右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）、和颈内动脉（ICA），并小心分离迷走神经，分别电凝ECA分支枕动脉和甲状腺上动脉。在距CCA分叉大约1cm处结扎ECA近心端，电凝远心端。用无创小动脉夹夹闭CCA，在ECA残端距CCA分叉3mm处剪一小口，将制备好的线栓经ECA插入ICA，线栓头端距CCA分叉处约18mm，此时进线有轻微阻力，栓线正好插至颅内的大脑前动脉，堵住大脑中动脉 （MCA）开口，制成MCAO模型。造模后2h，以半剂量10%水合氯醛再次麻醉动物，拔出线栓，结扎ECA残端。术后20～25℃条件下饲养大鼠，自由进食水。假手术组除不在颈内动脉插入线栓外，其余步骤与上述相同。

1.4.2 分组与给药 将21只大鼠随机分成3组，每组7只，分别为模型组、给药组、假手术组。给药组给予补阳还五汤煎剂原方剂量，黄芪120g，当归尾6g，赤芍5g，地龙3g，川芎3g，桃仁3g，红花3g。用水煎煮两次合并混匀。模型组与假手术组均给予生理盐水。每日一次，连续给药7d。

1.4.3 SOD、GST、GSH－Px的活力测定 大鼠于缺血再灌注24h后断头取脑，冰上分离缺血侧大脑皮质适量，在冰浴中匀浆，用0.9%生理盐水制成10%的组织匀浆液。4000r／min离心10 min，取上清。采用WST－1方法测定脑组织中SOD活力，CDNB法测定GST活力，采用酶联免疫吸附法测定GSH－Px活力。

1.4.4 MDA的含量测定 按“1.4.3”中的方法获得脑组织匀浆液，采用硫代巴比妥法测定脑组织中MDA含量。

1.5 统计学处理 数据采用SPSS17.0软件进行统计分析，所有结果以均数标准差 （）来表示，组间差异用t检验分析结果，以P＜0.05为差异有统计意义。

2 实验结果

模型组与假手术组比较，SOD的活力显著降低 （P＜0.01），GST的活力显著降低（P＜0.01），GST的活力显著降低（P＜0.01），GSH－Px的活力显著降低（P＜0.01），其差异具有统计学意义；补阳还五汤组与模型组比较，SOD的活力显著提高（P＜0.05），GST的活力显著提高（P＜0.05），GSH－Px的活力显著提高（P＜0.05），其差异具有统计学意义；模型组与假手术组比较，MDA含量显著升高（P＜0.01），其差异具有统计学意义；补阳还五汤组与模型组比较，补阳还五汤组显著降低MDA含量（P＜0.05），其差异具有统计学意义。结果见表1。

表1 补阳还五汤对MCAO大鼠脑组织MDA含量和SOD、GST、GSH－Px活力的影响（n＝7，）

表1 补阳还五汤对MCAO大鼠脑组织MDA含量和SOD、GST、GSH－Px活力的影响（n＝7，）

注：与假手术组比较，＃P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05。

组别 SOD（U／mg） GST（U／mg） GSH－Px（U／mg） MDA（nMol ）.18模型组 115.00±9.43＃ 79.26±9.95＃ 211.11±34.43＃ 1.10±0.19＃补阳还五汤组 136.85±25.94* 101.48±25.14* 234.34±40.44* 0.90±0.16假手术组 105.47±8.47 71.08±3.90 202.00±10.66 1.35±0 *

3 讨论

脑血管疾病以高发病率、高致残率、高复发率己成为严重威胁人类生命与健康的主要疾病之一，随着我国老龄化社会的到来，其发病率呈明显上升趋势。脑血管疾病主要包括缺血性和出血性脑卒中，其中以缺血性脑卒中最常见，而大脑中动脉 （MCA）是人群脑缺血的多发部位。

超微补阳还五汤能明显降低组织内的血浆丙二醛（MDA）和增加超氧化物歧化酶（SOD）活性，并增强大鼠脑组织神经生长因子 （NGF）的表达［5］；加味补阳还五汤对8Hz 130dB次声暴露下小鼠大脑过氧化水平及超微结构具有改善作用［6］。基因芯片分析补阳还五汤对局灶性脑缺血再灌注大鼠保护作用机制的研究显示，该方可上调多种抗氧化酶的基因，包括谷胱甘肽－S－转移酶 （GST），谷胱甘肽过氧化物酶－1（Gpx－1）、硫氧还蛋白（Tdpx1）等［7］。大量研究显示，补阳还五汤对抗脑缺血所致的氧化应激损伤而具有神经保护作用。自由基介导的氧化应激损伤广泛参与脑缺血性中风的神经病理机制。缺血性中风发生时，神经元由于失去氧和葡萄糖的供应，不能维持其静息电位而使得动作电位发放，兴奋性氨基酸异常释放，过度增加的兴奋性氨基酸又进一步激活神经元使之去极化，促使Ca2＋大量内流，Ca2＋超载激活多种细胞酶，使自由基大量生成，造成神经元应激和死亡。自由基使膜脂质过氧化，破坏细胞功能，且过多的自由基会造成神经元持续而致命的损伤［8］。脂质过氧化的终产物 （MDA）有很强的毒性和反应性，它们可使脂质过氧化在细胞膜系统蔓延导致细胞功能的破坏，所以测量MDA的含量被认为是氧自由基损伤的重要指标。在正常状态下，机体ROS的产生和清除间存在着动态的平衡，产生的自由基可被SOD、GSH－Px、GST等抗氧化酶清除，故测定抗氧化酶类的活性可以间接反映体内清除自由基的能力变化。脑缺血再灌注时，机体ROS的生成过多，超过了抗氧化酶对它的清除，就会导致氧化应激和细胞损伤。脑缺血大鼠再灌注后，SOD、GSHPx、GST活性显著降低，MDA含量明显升高，表明脑缺血再灌注期脂质过氧化增加，机体抗氧化能力降低。本实验的测定结果显示补阳还五汤能显著提高SOD、GSH－Px、GST的活性，降低MDA的含量，表明补阳还五汤对脑损伤的保护作用与其抗氧化作用有关，药物的作用机制可能为通过提高缺血再灌注脑组织SOD、GST、GSH－Px等抗氧化酶的活性，从而能清除氧自由基，起保护作用。

［1］姚晖，张继平.补阳还五汤抗血栓实验研究进展 ［J］.中国中医药信息杂志，2006，13（5）：95－97.

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［6］范建中，杨俊峰，陈景藻，等.加味补阳还五汤对8Hz 130dB次声暴露下小鼠大脑过氧化水平及超微结构的影响［J］.中国康复医学杂志，2007，22（4）：296－298.

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［8］邵福源，王宇卉.分子神经药理学 ［M］.上海：上海科学技术出版社，2005.

The Protection and M echanism of Buyang huanwu tang on Focal Cerebral Ischem ia－Reperfusion in Rats

ZHU Xue-qin1HAN Jing2HU Juan1，2PANGWen-sheng1，3*
1.FuJian University of Traditional Chinese Medicine of Pharmacy，Fuzhou 350122，China；2.FuJian Institute of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350003，China；3.Fujian Seeond Peopleis Hospited.Fuzhou 350000，China

Objective To investigate the protection andmechanism of Buyang huanwu tang on focal cerebral in rats.Methods Focal cerebral ischemia－reperfusion modelwasmadewith sutur－occludedmethod in rats.Dose group was given Buyang huanwu tang，Model group and Sham group were given physiological saline.Then they were given once a day for seven consecutive days.The volume of cerebral in farction，the level of MDA in serum，the activities of SOD、GST and GSH－Px in serum were rileasured.Resu lts Buyang huanwu tang could increase the activities of SOD、GST and GSH－Px in serum and decrease MDA level.Conclosion Buyang huanwu tang has significant protection again cerebral ischemia－reperfusion injury.This effectmay be related to its antioxidant property.

Buyang huanwu tang；Cerebral Ischemia－Reperfusion Injury；SOD；GST；GSH－PX；MDA

R285.5

A

1007－8517（2015）01－0042－02

2014.09.30）

福建省中医药研究院自主选题（2012fjzzyk－4）资助项目。

朱雪钦，女，在读硕士研究生，从事天然药物化学研究。E－mail：343138655＠qq.com

庞文生，E－mail：pws＠fjtcm.edu.cn