敦煌平胃丸对胃癌前病变大鼠Notch信号通路中Notch2和Jagged1表达的影响

付 航刘喜平，2*张 炜李沛清

1.甘肃中医学院基础医学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃中医学院敦煌医学与转化省部共建教育部重点实验室，甘肃 兰州 730000；3.兰州大学第一医院，甘肃 兰州 730000

敦煌平胃丸对胃癌前病变大鼠Notch信号通路中Notch2和Jagged1表达的影响

付 航1刘喜平1，2*张 炜3李沛清1

1.甘肃中医学院基础医学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃中医学院敦煌医学与转化省部共建教育部重点实验室，甘肃 兰州 730000；3.兰州大学第一医院，甘肃 兰州 730000

目的：观察敦煌平胃丸对胃癌前病变（PLGC）模型大鼠胃黏膜组织Notch信号通路中Notch2和Jagged1表达的影响。方法：采用复合法建立PLGC大鼠模型，将32只大鼠随机分为4组，每组8只。敦煌平胃丸组用敦煌平胃丸浸膏按每日生药96 g／kg掺入饲料中喂养给药，共计12周。观察大鼠胃黏膜病理组织学变化；采用Western Blot检测Notch2和Jagged1蛋白表达；采用RT－PCR检测Notch2和Jagged1mRNA的表达。结果：PLGC大鼠胃黏膜组织Notch2与Jagged1mRNA及蛋白表达较正常大鼠胃黏膜组织均明显上调（P＜0.05）。敦煌平胃丸能明显改善PLGC大鼠胃黏膜腺体萎缩、肠化增生，下调PLGC大鼠胃黏膜组织中Notch2与Jagged1表达水平（P＜0.05）。结论：Notch2、Jagged1激活了Notch信号通路，在PLGC发生发展中有重要意义。敦煌平胃丸治疗PLGC可能与下调Notch信号通路中Notch2与Jagged1表达有关。

敦煌平胃丸；胃癌前病变；Notch2、Jagged1

胃癌前病变（gastric precancerous lesions，PLGC）是胃黏膜肠上皮化生（intestinalmetaplasia，IM）和异型增生（Dysplasia，Dys）的一种病理状态。研究显示Notch信号通路参与了胃黏膜的癌变过程［1］。敦煌平胃丸源于敦煌遗书，该方临床治疗慢性萎缩性胃炎及胃癌前病变疗效确切［2－3］。为了进一步揭示敦煌平胃丸的药效及作用机理，本研究以PLGC大鼠为模型，研究了敦煌平胃丸对胃黏膜Notch信号通路中Notch2和Jagged1表达的影响，现报道如下。

1 材料

1.1 实验动物 采用SPF级健康Wistar大鼠，体重（160 ±10）g，雌雄各半，标准饲料喂养，均由甘肃中医学院SPF级医学实验中心提供，动物许可证号：SCXK（甘）2011－0001－0001163。

1.2 实验药物 敦煌平胃丸 （方药组成：人参、土鳖虫、当归、苦参、大黄、桔梗、干姜、防风、篙本、玄参），药材饮片购自兰州复兴厚药材有限责任公司，经甘肃中医学院中药鉴定教研室鉴定符合药典规定。将处方中药材饮片按一定比例，置多能提取器中，加水煎煮两次，第一次加8倍量水，煎煮1.5h，第二次加6倍量水，煎煮1h，合并两次煎液，离心滤过，滤液减压浓缩至含生药2g／m l的浸膏，保存备用。

1.3 试剂及仪器 甲基硝基亚硝基胍（MNNG），购自上海国药集团化学试剂有限公司，批号M0527；Notch2及Jagged1抗体购自兰州维科生物工程有限公司 （批号RMA0546）；胎牛血清购自兰州维科生物工程有限公司；EastepTM通用型总RNA提取试剂盒：型号LS1OO，普洛麦格上海生物产品有限公司；RNAse－Exitus PLUS（德国Applichem公司），批号OD008558；超声波破碎仪（德国merck公司）；超微量分光光度计 （K5500北京凯奥科技公司）；凝胶成像分析仪（170－8170，美国BIO RAD公司）；PCR热循环仪（C1000，美国BIO RAD公司）。

2 方法

2.1 大鼠模型建立及分组给药

2.1.1 PLGC大鼠模型建立 参考文献方法［4］，采用复合法建立PLGC模型：用蒸馏水175ml和40℃50%的酒精75m l充分搅匀配成10g／l的母液250m l（每周配1次），于4℃冰箱保存。使用前将MNNG加入母液，稀释成浓度为100μg／ml的溶液，避光保存。各造模组大鼠自由饮用MNNG与酒精复合溶液；各造模组大鼠雷尼替丁与60℃150g／热盐水按2.25g／L混合后灌胃。各造模组大鼠均配合饥饱失常（2d饱食，1d禁食）。

2.1.2 分组及给药 32只大鼠适应性喂养7 d后，随机分为4组，每组8只：空白对照组，常规喂养；PLGC模型组，按照前述方法造模，常规喂养，共计12周；自然恢复组，按前述方法造模，常规喂养，共计12周，第13周造模结束后，继续常规喂养12周；敦煌平胃丸组，按照前述方法造模，常规喂养，共计12周，第13周开始，按每日生药96g／kg剂量（相当于60kg成人剂量的20倍计算），将敦煌平胃丸浸膏，掺入饲料中喂养12周。

2.2 各组大鼠胃黏膜病理组织观察及积分 将大鼠禁食24h后 （自由饮水），腹部注射20%乌拉坦（约10m l／kg），剖腹取胃，沿胃大弯切开，PBS溶液漂洗2遍后，肉眼观察大鼠胃壁弹性、黏膜色泽。剪取胃窦部胃组织，将其置于10%多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切片，染色，光镜下观察胃黏膜厚度，腺体排列及肠化增生情况。参考文献方法 ［5］，分别从胃黏膜充血、炎性程度、胃黏膜糜烂程度、胃黏膜萎缩、肠化增生等方面进行评分。

2.3 Western Blot检测各组大鼠胃黏膜组织Notch2和Jagged1蛋白的表达 取胃窦组织，每100mg组织加1m l预冷的蛋白提取试剂，提取组织蛋白质。超声破碎仪粉碎组织，加入RIPA缓冲液匀浆，超微量分光光度计测蛋白质浓度；取100μl上清液，取相同质量的细胞裂解液，并加等体积的电泳加样缓冲液，沸水浴中3min，上样、电泳 （浓缩胶20mA，分离胶35mA），电转膜仪转膜（100mA 40min），膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色，Western blot ECL试剂盒显色，采用博德公司的凝胶成像分析系统进行图像采集，并用Quantity One4.2软件分析目标条带蛋白与β－actins蛋白的积分光密度比值，计算相对量。

2.4 RT－PCR检测各组大鼠胃黏膜组织Notch2和Jagged1 mRNA的表达 取胃窦组织，提取总RNA，紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度。cDNA的合成采用5μl逆转录反应体系，42℃反应60m in。反应条件：变性，95℃，2min；退火，42～65℃，1min，25～35循环；延伸，72℃，5min。使用Promega公司的GO Tap Green Master Mix进行PCR扩增，将扩增物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳。PCR引物由采用Primer prem ier 5及Oligo 6等生物软件进行引物设计，目的基因片段长度设计为100bp，内参片段长度设计为150bp。Notch2和Jagged1基因引物见表1。采用博德公司的凝胶成像分析系统进行图像采集，并用Quantity One4.2软件分析目标条带mRNA与β－actins的mRNA的积分光密度比值，计算相对量。

表1 Notch2和Jagged1检测中RT－PCR引物序列

2.5 统计学方法 用IBM SPASS 19.0统计软件对数据结果进行处理分析，数据以均数 ±标准差 （）表示。采用单因素方差分析的方法，进行方差齐性检验后，组间的比较采用LSD与SNK法检验。检验水准为0.05。

3 结果

3.1 各组大鼠胃黏膜组织病理观察及积分 结果见图1、表2。正常组大鼠胃黏膜腺体排列整齐，紧密呈管状，细胞层次清晰，腺上皮及基底层细胞排列规则，黏膜下平滑肌层完整，沿上皮排列，未见特异改变；PLGC模型组大鼠胃黏膜腺体可见结构紊乱、形态不规则、排列拥挤、并有复层及背靠背现象，细胞核极性消失，胞核增大、深染、异形，核呈空泡状，胞浆嗜碱，间质水肿，充血，淋巴细胞、浆细胞、中性粒细胞、嗜酸性细胞浸润；自然恢复组大鼠胃黏膜结构紊乱，形态不规则，部分区域灶状轻度增生腺或可见部分区域肠上皮化生；敦煌平胃丸治疗组大鼠胃黏膜异型增生较模型组有不同程度改善，主要为炎性改变。

图1 各组大鼠胃黏膜病例组织学变化

表2 各组大鼠胃黏膜病理组织评分（）

表2 各组大鼠胃黏膜病理组织评分（）

注：与空白对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较：△P＜0.05，△△P＜0.01。

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3.2 各组大鼠胃黏膜组织Notch2和Jagged1蛋白的表达

结果见图2、表3。与正常大鼠胃黏膜组织比较，PLGC模型组大鼠胃黏膜组织Notch2与Jagged1蛋白表达均明显上调（P＜0.05）。自然恢复组有所降低，但不显著。经敦煌平胃丸干预后Notch2与Jagged1蛋白表达水平明显下降（P＜0.05），但仍高于正常组。

表3 各组大鼠胃黏膜组织Notch2及Jagged1的蛋白表达（）

表3 各组大鼠胃黏膜组织Notch2及Jagged1的蛋白表达（）

注：与空白对照组比较，ΔP＜0.05；与模型组比较，★P＜0.05。

8 1.2976±0.3167 0.8970±0.0457 PLGC模型组 8 7.0527±0.0727Δ 1.5549±0.0076Δ自然恢复组 8 6.8478±0.0501Δ 1.0293±0.0891敦煌平胃丸组 8 1.7557±0.0659★ 0.9382±0.0541 Notch2 Jagged1空白对照组组别 例数★

3.3 敦煌平胃丸对PLGC大鼠胃黏膜组织Notch2 mRNA表达的影响 结果见表图3、表4。与正常大鼠胃黏膜组织比较，PLGC模型组大鼠胃黏膜组织Notch2与Jagged1mRNA表达均明显上调（P＜0.05）。自然恢复组有所降低，但不显著。经敦煌平胃丸干预后Notch2与Jagged1mRNA达水平明显下降（P＜0.05），但仍高于正常组。

表4 各组大鼠胃黏膜组织Notch2及Jagged1 mRNA的表达（）

表4 各组大鼠胃黏膜组织Notch2及Jagged1 mRNA的表达（）

注：与空白组相比，ΔP＜0.05；与模型组相比，★P＜0.05。

8 0.6948±0.0861 0.1116±0.0146 PLGC模型组 8 5.2342±0.2113Δ 3.6767±0.2419Δ自然恢复组 8 3.0933±0.0936Δ★ 2.4724±0.0122Δ敦煌平胃丸组 8 0.9245±0.0752Δ★ 0.3658±0.0468 Notch2 Jagged1空白对照组组别 例数Δ

4 讨论

Notch信号通路广泛存在于脊椎动物和非脊椎动物，进化上高度保守［6］。Notch信号通路由Notch受体、Notch配体（DSL蛋白）、CSL（CBF－1，Suppressor of hairless，Lag的合称）DNA结合蛋白等组成。已知哺乳动物有Notch1、Notch 2、Notch 3、Notch4等4种Notch受体和Deltal、Delta3、Delta4、Jaggedl、Jagged2等5种配体。当Notch受体与邻近的细胞表面的配体相结合时，其胞内区被切割，从细胞膜上脱离，转运进入细胞核并与下游分子相互作用以传递Notch发挥生物学功能［7］。研究表明Notch信号转导系统中Notch1－3受体及Jaggedl、Jagged2、Delta1等配体在正常胃黏膜中都有表达，在胃癌组织中则呈现高表达［8］，提示Notch信号通路可能参与了胃黏膜的癌变过程。但Notch信号通路是否参与了PLGC发生发展，尚未见到相关报道。

PLGC属中医“胃痞”范畴。中医认为PLGC的发生是一个邪气渐深，正气渐伤的过程，这与 “慢性胃炎萎缩性胃炎肠上皮化生异型增生胃癌”的疾病模式有相似之处。胃黏膜炎症经过长期病理演变，初起在经在气，以脾胃失和，气机阻滞为主，久则在络在血，寒湿、郁热、瘀血等邪毒蜂起，使胃络不通；久则耗伤正气，脾胃虚弱，气阴亏虚，胃络失于濡养，导致腺体萎缩、黏膜肠化增生，数证交错，相互制，从而使病势胶着，迁延不愈。故我们认为毒邪内蕴、胃络不通、胃络损伤是炎症诱导PLGC发生的关键病机；脾虚阳陷、气阴亏虚、胃络失养是PLGC的病理转归；虚实夹杂、寒热错杂是其主要证候特征。

基于上述认识，我们提出 “消散毒邪，以通胃络，升阳健脾、益气养阴以养胃络”治疗PLGC的思路。敦煌平胃丸组方用药符合这一治疗思路，是我们临床治疗PLGC的常用方剂，疗效显著。该方源于敦煌遗书P·3287卷子［9］，由人参、土鳖虫、当归、苦参、大黄、玄参、干姜、防风、篙本、桔梗等组成。方中以土鳖虫、大黄、当归活血祛瘀，通经活络，以解瘀毒阻滞胃络；苦参、干姜辛开苦降，恢复中焦升降之职，以解寒湿、邪热内蕴毒邪，佐以甘寒濡润之玄参，与当归合用滋阴养血，防止久病入络，耗伤胃络阴血，又可制约方中辛苦温燥药物伤及阴血；防风、篙本、桔梗均为辛散升浮之品，与人参配伍共奏升阳健脾。全方虚实兼顾，寒热平调，润燥结合；既消散毒邪，畅通胃络，又升阳健脾、益气养阴，荣养胃络。

本研究结果表明PLGC模型大鼠胃黏膜组织Notch信号通路中受体Notch2与配体Jagged1mRNA及蛋白表达较正常大鼠胃黏膜组织均明显上调。经自然恢复后这种高表达水平并未明显改变，敦煌平胃丸则能明显下调PLGC大鼠胃黏膜组织中Notch2、Jagged1 mRNA及蛋白表达水平。我们推测Notch2作为的受体、Jagged1作为配体激活了Notch信号通路，促进了胃黏膜腺体萎缩、肠化增生。敦煌平胃丸治疗PLGC可能与下调Notch信号通路中Notch2与Jagged1表达，促进胃黏膜组织修复与重构有关。至于PLGC过程中是否还有其他Notch信号通路受体及配体或相关下游基因参与，敦煌平胃丸对其是否具有干预调节作用，有待于进一步研究。

［1］杨晓东，张辉，白志刚.Notch信号通路在胃癌组织中的表达及其意义［J］.中华普通外科杂志，2009，24（2）：146－148

［2］张炎.敦煌平胃丸加减治疗慢性萎缩性胃炎56例疗效观察［J］.中国民族民间医药杂志，2010，（10）：175－175.

［3］刘喜平.敦煌医方的理论与实践［M］.北京：中医古籍出版社，2012：75.

［4］谢晶日，王业莉，张扬，等.复合造模法建立大鼠胃癌前病变模型的实验研究［J］.新中医，2013，45（2）：139－140.

［5］孙宁，刘旺根，王雪萍，等.黄芪建中汤对脾虚型慢性萎缩性胃炎大鼠胃黏膜病理形态影响的研究［J］.河南中医学院学报，2005，9（5）：11－12.

［6］孙丽哲，侯林.Notch的结构功能和相关信号通路［J］.中国细胞生物学学报，2010，32（6）：914－921.

［7］Nam Y，Aster J C，Blacklow S C.Notch signaling as a therapeutic target［J］.Curr Opin Chem Biol，2002，6（4）：501.

［8］Sander GR，Powell BC.Expression of notch receptors and ligands in the adults gut［J］.Histochem Cytochem，2004，52（4）：509－516.

［9］刘喜平.敦煌 《亡名氏脉经》佚方考 ［J］.中国中医基础医学杂志，2012，18（4）：362－365.

Effects of Dunhuang pingwei pill on expression of Notch2 and Jagged1 in the Notch signal pathway in rats w ith precancerous lesions of gastric cancer.

FU Hang1，LIU Xi-ping1，2，ZHANGWei3，LIPei-qing1
1.School of Basic Medical，Gansu University of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730000，China；2.Key Laboratory of Education Ministry“Dunhuang Medicine and Translation”from University of Traditional Medicine，Lanzhou 730000，China；3.Surgical Department of Lanzhou University First Hospital，Lanzhou 730000，China

Objective To observe the Dunhuang pingweipill on the expression of Notch2 and Jagged1 in the Notch signal pathway in ratswith precancerous lesions of gastric cancer.M ethods To establish the ratmodel of PLGC by using compositemethod，32 rats were random ly divided into 4 groups，8 rats in each group，Dunhuang pingwei pill group were fed with Dunhuang pingwei concrete according to daily crude drug 96 g／kg soak in feedstuff，a total of12 weeks.Observe changes in gastricmucosa pathological histology in rats.Using Western Blot to detect protein expression of Notch2 and Jagged1，the transcriptions of Notch2 and Jagged1mRNA were demonstrated by RT－PCR technique.Result Compared to the normal rats，Notch2 and Jagged1mRNA、protein expression were significantly up－regulated in gastric mucosa histology in rats with PLGC.（P＜0.05）.Dunhuang pingwei pill can obviously improve the gastric mucosa gland atrophy，intestinalmetaphases and hyperplasia，down－regulate the expression level of Jagged1andNotch2 in gastricmucosa tissue in ratswith PLGC.（P＜0.05）.Conclusion Notch2，Jagged1 activates Notch signaling pathways in PLGC，it is important to the developmentof PLGC.Dunhuang pingweipill in the treatmentof PLGCmaybe associated with down－regulating expression of Notch2 and Jagged1 in Notch signal pathway.

Dunhuang pingwei pill，PLGC，Notch2，Jagged1

R285.5

A

1007－8517（2015）01－0018－04

2014.10.07）

甘肃省高校基本科研业务费专项资金项目（编号：2011－3）。

刘喜平，男，教授，E－mail：lxpd－257＠163.com