新型伊立替康衍生物ZBH-1208的体外抗肿瘤活性及机制研究

2015-06-05 15:32史卫国仲伯华张馨月赵大玮王学林
中国实验诊断学 2015年2期
关键词:吉林长春伊立细胞周期

赵 静,于 鸿,吴 荻,史卫国,仲伯华,刘 菁,张馨月,赵大玮,王学林

(1.吉林大学动物医学学院人兽共患病研究所人兽共患病研究教育部重点实验室,吉林长春130062;

2.吉林省肿瘤防治研究所细胞生物研究室,吉林长春130012;3.吉林大学第一医院肿瘤中心,吉林长春130021;

4.军事医学科学院毒物药物研究所,北京100850;5.中国科学院长春应用化学研究所,吉林长春130022;6.吉林省肿瘤医院乳腺科,吉林长春130012)

新型伊立替康衍生物ZBH-1208的体外抗肿瘤活性及机制研究

赵 静1*,于 鸿2*,吴 荻3,史卫国4,仲伯华4,刘 菁1,张馨月5,赵大玮6,王学林1

(1.吉林大学动物医学学院人兽共患病研究所人兽共患病研究教育部重点实验室,吉林长春130062;

2.吉林省肿瘤防治研究所细胞生物研究室,吉林长春130012;3.吉林大学第一医院肿瘤中心,吉林长春130021;

4.军事医学科学院毒物药物研究所,北京100850;5.中国科学院长春应用化学研究所,吉林长春130022;6.吉林省肿瘤医院乳腺科,吉林长春130012)

目的研究新型伊立替康衍生物ZBH-1208体外对肿瘤细胞的生长抑制作用并初步探讨其作用机制。方法采用四甲基偶氮唑盐比色(MTT)法检测分析ZBH-1208对人宫颈癌HeLa细胞、人非小细胞肺癌A549细胞、人小细胞肺癌NCI-H446细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、人结肠癌SW1116细胞、人胃腺癌SGC-7901细胞、人肝癌SMMC-7721细胞及人胚肾293细胞的生长抑制作用,计算IC50值;流式细胞术检测ZBH-1208对肿瘤细胞周期及活化Caspase-3表达的影响。结果ZBH-1208对肿瘤细胞的生长具有抑制作用,呈剂量-时间依赖关系。ZBH-1208作用各肿瘤细胞后IC50值在0.002μmol/L-0.265μmol/L之间,而对照组伊立替康(CPT-11)的IC50值在0.464μmol/L-52.111μmol/L之间,两者相比较差异均有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术检测结果显示,ZBH-1208诱导肿瘤细胞发生G2/M期阻滞,百分比到达90%以上;并且诱导活化形式Caspase-3表达增加。结论与CPT-11相比,新型化合物ZBH-1208具有高效低毒、起效快的特点,可使肿瘤细胞发生细胞周期阻滞,并诱导肿瘤细胞凋亡,具有进一步研究开发的价值。

伊立替康;衍生物;细胞周期阻滞;细胞凋亡

(Chin J Lab Diagn,2015,19:0181)

喜树碱(Camptothecin,CPT)是美国化学家Wall ME和Wani MC在1966年首先从中国珙桐科植物喜树(Camptothecaacμminata)中提取,对多种实体瘤具有治疗作用的天然生物碱[1]。天然喜树碱水溶性极差,限制了其开发应用。1983年日本Yakult和Painichi公司研制出水溶性好的喜树碱类衍生物伊立替康(Irinotecan,CPT-11)。CPT-11是7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)的一种水溶性前药,改善了喜树碱水溶性差的问题,有利于喜树碱的胃肠道吸收,临床上用于治疗结肠直肠癌、胃癌、宫颈癌、卵巢癌、肺癌和恶性淋巴瘤等恶性肿瘤[2]。然而,CPT-11在体内发挥作用时,必须由羧酸酯酶催化转化为活性形式SN-38,其效率较低,而且CPT-11对乙酰胆碱酯酶(AchE)具有抑制作用,会引起严重的毒副作用,如腹泻和骨髓抑制[3,4]。因此,此类型喜树碱前药有待进行进一步研究开发。近年来国内外已报道多种新型改构化合物,可以克服伊立替康的缺陷,降低毒副反应,提高药物疗效[5-9]。本研究通过分析喜树碱类衍生物的构效关系和选择合适的载体,对其进行结构改造与修饰,合成了一系列新型伊立替康衍生物。初步的体外实验已表明,新型化合物具有高于伊立替康的体外抗肿瘤作用,可以更快的水解为SN-38或以SN-38为母体、水溶性高并能克服伊立替康对乙酰胆碱酯酶抑制作用导致的毒副作用,同时增强药物对肿瘤的靶向性。

本文报道的ZBH-1208是我们挑选的一个代表性的化合物,实验采用MTT法测定ZBH-1208对多种肿瘤细胞株的体外生长抑制作用,并以人结肠腺癌SW1116细胞为靶细胞,研究药物对SW1116细胞周期和凋亡的影响,初步探讨药物作用机制,为进一步深入的体内外研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

IMDM培养基购自Gibco;胎牛血清购自Hyclone公司;四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司;RIPA细胞裂解液、ECL化学发光试剂盒购自碧云天公司;PVDF膜购自Roche公司;Caspase-3抗体、β-actin抗体、HRP标记的山羊抗小鼠及山羊抗兔IgG购自Santa Cruz公司;PARP抗体购于Abcam公司;COULTER○RDNA PREPTMReagents Kit购自Beckman Coulter公司;FITC Active Caspase-3Apoptosis Kit为BD公司产品。

1.2 细胞株及受试药物

人非小细胞肺癌A549细胞、人小细胞肺癌NCI-H446细胞、人宫颈癌HeLa细胞、人胃腺癌SGC-7901细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、人结肠癌SW1116细胞、人肝癌SMMC-7721细胞及人胚肾293细胞株均由吉林省肿瘤研究所提供。细胞常规培养于IMDM培养基中,0.25%胰酶消化传代。伊立替康(CPT-11)、SN-38、ZBH-1208由中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所设计合成并提供。药物由DMSO溶解至100mmol/L,IMDM培养基稀释,于-20℃保存备用。

1.3 MTT法检测ZBH-1208的体外抗肿瘤活性

7种肿瘤细胞株(HeLa、A549、MCF-7、SW1116、NCI-H446、SGC-7901、SMMC-7721)和人正常二倍体293细胞株常规传代培养,待细胞生长至指数期时,调整细胞密度至2.5×104个/ml接种于96孔培养板,待细胞贴壁后加药。实验设空白对照组,DMSO溶剂对照组,CPT-11阳性对照组和ZBH-1208组。药物浓度依次为0.0032μmol/L、0.016μmol/L、0.08μmol/L、0.4μmol/L、2μmol/L、10μmol/L、50μmol/L,每个浓度设6个复孔。继续培养48h后,每孔加入浓度为5mg/ml的MTT 20μl,作用4h后弃去上清液,每孔加入150 μl DMSO,轻微振荡使甲瓒充分溶解。酶标仪测定492nm波长处的各孔吸光度(OD值)。实验重复3次,按以下公式计算ZBH-1208和CPT-11对肿瘤细胞生长抑制率,采用回归方程计算药物的半数抑制浓度(IC50值)。

肿瘤细胞抑制率(%)=1-[(实验组OD均值-空白对照组OD均值)/(细胞对照组OD均值-空白对照组OD均值)]×100%

1.4 流式细胞术检测ZBH-1208对SW1116细胞周期的影响

取对数生长期的SW1116细胞,调整细胞密度至5.0×105个/ml,接种于6孔板。待细胞贴壁后加入ZBH-1208、CPT-11、SN-38,药物终浓度均为25μmol/L,37℃、5%CO2培养箱中培养48h后,收集细胞至离心管中,用预冷PBS洗涤细胞,重悬细胞在流式上样管中,调整细胞浓度为1.0×106个/ml。按照DNA Prep Reagents Kit说明书,每管加入100μl DNA Prep LPR,轻轻混匀,室温避光反应1min。加入1ml DNA Prep Stain,轻轻混匀,室温避光反应15-20min。300目尼龙网过滤细胞,上机检测(Beckman Coulter Epics XL/MCL),Multi-Cycle软件分析实验结果。

1.5 流式细胞术检测ZBH-1208对肿瘤细胞的活化Caspase-3表达的影响

收集对数生长期的SW1116细胞,调整细胞密度为5.0×105个/ml,接种于6孔板。待细胞贴壁后加入ZBH-1208、CPT-11、SN-38,终浓度均为25 μmol/L。37℃、5%CO2培养箱中培养24h、48h、72h后收获各组细胞,预冷PBS洗涤细胞后重悬细胞在500μl BD Cytofix/Cytoperm solution中,冰上孵育20min,1000rpm离心5min,弃上清。每个样本用100μl BD Perm/Wash buffer和5μl FITC Caspase-3抗体重悬细胞,室温避光孵育30min。300目尼龙网过滤细胞,流式细胞仪检测细胞活化Caspase-3表达。

1.6 统计学分析

采用SPSS19.0软件,student-t检验进行统计学分析,P<0.05表示实验组与对照组相比有显著性差异,P>0.05表示无显著性差异。

2 结果

2.1 ZBH-1208的体外抗肿瘤活性

实验选择的靶细胞来源于宫颈癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌和肝癌等有代表性的实体瘤并选择一个正常二倍体293细胞作为正常细胞对照比较药物对正常细胞的作用。MTT实验结果表明,ZBH-1208、CPT-11作用细胞48h后,ZBH-1208和CPT-11均可显著抑制各肿瘤细胞增殖并呈浓度和时间依赖性。ZBH-1208对HeLa、A549、MCF-7、SGC-7901、NCI-H446和SW1116细胞均显示出了较CPT-11更强的抑制细胞增殖的能力(图1),IC50值在0.002μmol/L-0.265μmol/L之间,CPT-11的IC50值在0.464μmol/L-52.111μmol/L之间,特别是ZBH-1208作用人结肠癌SW1116细胞后其IC50值仅为CPT-11的1/600(表1),表明ZBH-1208对肿瘤细胞的生长抑制作用高于CPT-11。值得注意的是,ZBH-1208对293细胞的杀伤作用明显低于CPT-11,这表明设计合成的新化合物具有高效低毒的特性。

表1 ZBH-1208和CPT-11作用后肿瘤细胞IC50比较

图1 不同浓度ZBH-1208和CPT-11对细胞生长抑制作用比较

2.2 ZBH-1208诱导细胞周期阻滞

CPT-11作为临床一线抗肿瘤药物通过影响细胞周期,使其不能进行正常的有丝分裂,从而抑制肿瘤细胞生长。本实验选用终浓度为25μmol/L的ZBH-1208作用于SW1116细胞48h后,结果显示ZBH-1208诱导SW1116细胞发生细胞周期阻滞。实验结果提示,ZBH-1208、CPT-11和SN-38作用SW1116细胞48h后,各组细胞中G2/M期细胞的百分比显著增加,同时G0/G1期细胞数显著降低。SN38的作用后,G2/M期细胞数目百分比在各组中最高,CPT-11次之,S期和G2/M期细胞比例明显升高,ZBH-1208处理后,SW1116细胞的细胞周期显著阻滞于G2/M期,百分比到达90%以上,其作用与SN38相当,明显优于CPT-11(图2)。

图2 药物对细胞周期分布的影响

2.3 ZBH-1208对SW1116细胞活化Caspase-3表达的影响

细胞凋亡是由半胱氨酸蛋白酶Caspase家族执行的胞内自杀程序,Caspase-3作为Caspase家族中最重要的凋亡执行者,是细胞发生凋亡机制的关键组成部分,在已知凋亡通路中发挥核心作用。为了研究ZBH-1208是否诱导caspase依赖的细胞凋亡,我们采用流式细胞术检测了药物作用后SW1116细胞活化Caspase-3的表达。终浓度为25μmol/L的ZBH-1208、CPT-11、SN-38和DMSO处理结肠癌SW1116细胞24h、48h、72h后,检测结果显示,ZBH-1208作用后SW1116细胞活化Caspase-3表达的百分比显著高于对照组,24h后即可见活化Caspase-3的表达高于CPT-11,与SN-38相当,DMSO溶剂对照组与不加药物的空白对照组相比没有明显差异;药物作用48h后ZBH-1208组活化Caspase-3高于SN-38处理组,低于CPT-11组;药物作用72h后,三组Caspase-3表达没有显著差异(图3)。

3 讨论

CPT-11作为临床一线抗肿瘤药物已得到广泛应用,但因其长期使用会产生耐药性及严重的毒副作用,在使用剂量上具有一定的限制性[10,11]。基于CPT-11或SN-38结构改造后新合成的化合物有望克服伊立替康的毒副作用。我们的前期研究设计合成了一系列CPT-11衍生物并初步评价了其药物特性。本研究选择其中一个新化合物ZBH-1208,体外实验研究药物抗肿瘤作用的机制,获得的结果表明,ZBH-1208可能作为一种新的癌症化学治疗剂继续深入开发应用。

经过体外初步研究,ZBH-1208表现出显著的生物活性,对肿瘤细胞尤其是胃肠道肿瘤细胞的生长表现出良好的抑制作用,明显强于母体化合物CPT-11,IC50值显著低于CPT-11(P<0.05),提示我们与ZBH-1208类似的一系列合成的新化合物具有超过CPT-11的作用。实验选取了七种肿瘤细胞株对ZBH-1208的体外抗肿瘤活性进行了初步评价,结果显示,ZBH-1208水溶性高,对乙酰胆碱酯酶的抑制作用低,可以克服CPT-11的毒副作用,体外抗瘤具有广谱性,对各株肿瘤细胞有较好的生长抑制作用,抗其抗肿瘤活性高于CPT-11和SN-38,药物在较低浓度时即可显著诱导肿瘤细胞凋亡,作用机制有别于CPT-11和SN-38,可能更多涉及凋亡信号通路的改变,更深入的药物作用机制有待进一步研究。

在真核生物中,细胞周期调控是细胞生长过程中的主要调节机制,G2/M期是细胞进行分裂之前在细胞周期中表现高度复杂的关键阶段,细胞周期阻滞在G2/M期,是各种DNA损伤剂表现出的共同细胞反应[12]。通过PI染色使用流式细胞术我们观察到新型化合物ZBH-1208引起细胞周期阻滞于G2/M期,提示ZBH-1208与母药CPT-11相似,是作为一种DNA损伤剂杀伤肿瘤细胞。同时ZBH-1208的抗肿瘤作用高于SN38。

图3 药物对活化Caspase-3蛋白表达的影响

除了控制细胞周期的调节,细胞生长过程中,细胞增殖与细胞凋亡之间保持着一种动态平衡是维持自身稳定的重要因素[13],细胞凋亡即细胞程序性死亡,是细胞分化成熟过程中普遍存在的途径,是半胱氨酸蛋白酶Caspase家族活化,开启胞内自杀的程序[14,15],一些治疗和化学预防剂可通过诱导细胞凋亡消除癌细胞。我们通过前期实验推测ZBH-1208杀伤肿瘤细胞,抑制肿瘤细胞生长可能通过诱导细胞凋亡实现。caspase-3在DNA损伤、修复、和诱导凋亡过程中扮演着重要的角色[16],本研究中我们应用流式细胞术验证了活化形式caspase-3的表达随药物浓度增高而上调,表明ZBH-1208可以增加肿瘤细胞活化caspase-3的表达水平,提示ZBH-1208可诱导肿瘤细胞发生凋亡且诱导凋亡是通过caspase途径实现的。我们在后续的试验中将会进一步深入分析,探究药物作用的确切机制。

综上所述,新型化合物ZBH-1208可以通过诱导细胞周期阻滞、肿瘤细胞发生凋亡来抑制其生长增殖。本研究对ZBH-1208的抗肿瘤作用进行了体外评价,对其抗肿瘤作用机制进行了初步研究,为CPT-11类似物的构效关系研究增添了新的内容,为同类化合物的结构修饰、改造和开发提供了研究思路、实验数据和理论参考。研究结果表明合成的新化合物具有进一步开发研究的价值。

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Study on anti-tumor activity and mechanism of novel Irinotecan derivatives ZBH-1208 in vitro

ZHAO Jing1*,YU

Hong2*,WU Di3,et al.(1.Key laboratory for Zoonosis Research,Ministry of Education,Institute of Zoonosis,Jilin University,Changchun 130062,China;2.Cell Biology Laboratory,Jilin Province Tumor Institute,Changchun 130012,China;3.Tumor Center of First Clinical Hospital,Jilin University,Chanchun130021,China)

ObjectiveTo investigate the inhibition effect on the growth of tumor cells of novel Irinotecan derivatives ZBH-1208in vitro and further probe its anticancer mechanisms.MethodsMTT assay was used to evaluate the preliminary anti-tumor effect of ZBH-1208on A549,NCI-H446,HeLa,SGC-7901,MCF-7,SW1116,SMMC-7721and 293cell lines.Cytotoxicity for the tumor cells was assessed by the tumor cell growth inhibition rates and IC50.Flow cytometry analysis was performed to analyze the expression of Caspase-3and cycle distribution of the tumor cells treated with ZBH-1208.ResultsZBH-1208had significant anti-proliferation effects on A549,NCI-H446,HeLa,SGC-7901,MCF-7,SW1116,SMMC-7721cell lines,and was dependence on concentration and time variant.IC50of seven cancer cell treated with ZBH-1208were significantly lower than that of CPT-11(P<0.05).Cell cycle of the tumor cells treated with ZBH-1208were arrested in G2/M phase.The expression of active Caspase-3in the tumor cell was generally up-regulated.ConclusionComparison with CPT-11and/or SN38,the novel compound ZBH-1208was more efficient and lowertoxicity in significant inhibit growth of the tumor cells.ZBH-1208play an important role in the apoptosis inducement of tumor cells by arresting the tumor cells cycle and would positive contribute to on further research in clinical treatment.

Irinotecan;Derivatives;Cell cycle arrest;Cell apoptosis

R965.3

A

赵静(1989-),女,内蒙古包头人,硕士研究生,研究方向:兽医公共卫生学研究。

2014-10-25)

1007-4287(2015)02-0181-06

吉林省科技发展计划应用基础研究项目(20130102097JC);吉林省卫生厅研究项目(2012Z037)

*通讯作者

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