乳腺癌中STC1的表达与乳腺癌肺转移相关

李佳涛 李 惠 胡国宏

（上海交通大学医学院/中国科学院上海生命科学研究院健康科学研究所 上海 200025）

乳腺癌中STC1的表达与乳腺癌肺转移相关

李佳涛 李 惠 胡国宏△

（上海交通大学医学院/中国科学院上海生命科学研究院健康科学研究所 上海 200025）

目的研究乳腺癌中分泌蛋白斯坦尼钙调节蛋白1（stanniocalcin 1，STC1）的表达与乳腺癌转移的关系。方法用质谱及Western blot分析STC1在具有不同转移能力细胞系中的蛋白表达情况。荧光定量RTPCR（qRT-PCR）分析STC1 mRNA在乳腺癌细胞系及23例患者样本中的表达情况，并通过网上数据库分析1 609例乳腺癌患者STC1 mRNA的表达水平与患者发生远端转移之间的关系。结果质谱及Western blot分析结果显示，具有高转移能力的乳腺癌细胞系高表达STC1。qRT-PCR分析结果显示，STC1在高转移乳腺癌细胞系中高表达，STC1在转移性乳腺癌患者中的表达高于非转移性患者。另外，通过对数据库中乳腺癌患者样本的分析发现，原位癌高表达STC1的乳腺癌患者更容易发生远端转移。结论STC1的表达与乳腺癌的转移具有相关性，提示STC1具有临床预测乳腺癌肺转移的潜在价值。

STC1； 乳腺癌； 肿瘤转移； 生物标志物

乳腺癌发病率高，对女性健康构成很大威胁，而乳腺癌转移是引起不良预后的重要原因［1］。肿瘤的转移具有器官特异性，其中乳腺癌最常见的转移部位是骨、肺、肝及脑［2］。乳腺癌骨转移会给患者带来疼痛、骨折和高钙血等，而乳腺癌的肺转移会给患者带来致命的伤害［3］。早期发现、早期预测乳腺癌的转移对于乳腺癌的治疗具有重要意义。

斯坦尼钙调节蛋白1（stanniocalcin 1，STC1）是一种分泌型糖蛋白，由STC1基因编码，位于人染色体8p11.2～p21。STC1最初发现于鱼类中，进一步研究发现人类及其他哺乳动物中也广泛存在STC1［4］。通过对哺乳动物中该蛋白的同源蛋白进行分析，还发现了另一斯钙素家族成员STC2［5］。STC1表达于多种组织，通过自分泌或旁分泌发挥功能［6］。目前已知STC1在调节肾及小肠钙磷平衡及细胞代谢等方面发挥着重要功能［7］，而对STC2的功能尚不清楚。

STC1及STC2在多种肿瘤组织的表达量都比对应的癌旁正常组织有明显升高或降低，提示STC可能与肿瘤的发生发展有关。研究发现在卵巢癌中STC1的表达较癌旁有所下调［8］；在肝癌组织中STC1的表达较癌旁有所上调［9］；STC2在肝癌中的表达也有上调且能促进肝癌细胞体外增殖能力［10］。乳腺癌中，STC1可能会被BRCA1基因诱导而产生［11］；在ER阳性乳腺癌中，STC1及STC2在肿瘤组织中的表达较癌旁正常组织明显上升［12］，其中STC2的高表达可能受激素调节［13］。另有研究提示STC1可做为乳腺癌的一种临床诊断标志物［14］。STC还参与肿瘤转移的过程，有研究显示肿瘤相关成纤维细胞（cancer associated fibroblast，CAF）分泌的STC1可以促进节肠癌细胞发生转移［15］；STC2与食管癌的淋巴节转移相关等［16］。具有低肺转移能力的乳腺癌细胞系中过表达STC1后，可以增强该乳腺癌细胞系的肺转移能力［17］。但是，STC1的表达是否与乳腺癌转移能力相关，以及在临床上STC1的表达与患者预后发生远端转移风险是否相关，尚不明确。因此，本研究旨在探讨STC1在乳腺癌中的表达与乳腺癌肺转移的关系，揭示STC1与乳腺癌转移的相关性，为预测及诊断乳腺癌的转移提供理论依据。

材料和方法

细胞培养LM2-4173及LM2-4175（分别简称4173及4175）来源于Joan Massague实验室［18］。MDA231、4173、4175以及4T1系列细胞的培养使用DMEM加10%胎牛血清、100 U/m L青霉素和100μg/m L链霉素的培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。MCF10系列细胞的培养（MCF10AT，MCF10CA1h，MCF10CA1a）使用DMEM/F12（HyClone）加10μg/m L胰岛素、20 ng/m L表皮生长因子、0.5μg/m L氢化可的松、100 ng/m L霍乱毒素，5%马血清，100 U/m L青霉素和100μg/m L链霉素的培养液、置于37℃、5%CO2培养箱中培养。

样本来源23例乳腺癌患者肿瘤样本均来自山东大学齐鲁医院，其中12例患者预后发生了肺转移，11例患者预后未发生转移，肿瘤样本分成转移组与非转移两组。网上乳腺癌患者样本数据来源于www.kmplot.com，选择研究对象为乳腺癌（breast cancer），考查指标为远端转移（distant metastasis free survival，DMFS）。将1 609例乳腺癌患者样本按表达的STC1中值分为两组：STC1高表达组和STC1低表达组，然后比较两组发生DMFS的生存曲线。

STC1 mRNA表达检测采用Trizol法提取细胞或组织总RNA，然后取RNA 1μg，利用随机引物及polyd T进行逆转录。随后用荧光定量RT-PCR （qRT-PCR）法检测具有不同转移能力的细胞系及乳腺癌患者样本中STC1 mRNA的表达水平，引物序列见表1。

STC1蛋白表达检测分泌蛋白收集方法及质谱分析方法参考文献［19］。分泌蛋白的Western blot检测使用10%SDS电泳分离，转膜后用丽春红（Ponceau S）确定上样蛋白量是否相同。兔源抗STC1一抗为多克隆抗体购于美国Gene Tex公司（批号：GTX47080）。荧光标记的抗兔二抗来源于Li-Cor公司。

统计学方法采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。qRT-PCR法检测STC1 mRNA表达，数据以±s表示。分析乳腺癌患者肿瘤样本时，采用Student's t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

质谱数据分析具有不同肺转移能力的乳腺癌细胞系的分泌蛋白为了找到在乳腺癌肺转移中起着重要作用的分泌蛋白，通过液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）分析来自具有不同遗传背景且具有不同肺转移能力的乳腺癌细胞系——MDA-MB-231系列（231及4175）和来自鼠源的4T1系列（67NR、168FARN、4TO7及4T1）的分泌蛋白情况。4T1系列细胞系（包括67NR、168FARN、4TO7、4T1）均来自小鼠自发乳腺癌模型，其中67NR及168FARN均无肺转移能力，4TO7及4T1细胞可以扩散到肺，但只有4T1能长成肉眼可见的转移灶［20-21］。MDA-MB-231（简称231）是肺转移能力较弱的人源乳腺癌细胞系，LM2-4173及LM2-4175（分别简称4173及4175）是来自于231细胞系的具有高肺转移能力的乳腺癌细胞系［18］。在这2个细胞系的分泌蛋白中，有7个蛋白被共同上调或者下调，包括蛋白酶分子和生长因子等。STC1是其中被共同上调的分泌蛋白之一，STC1在高肺转细胞系中具有高表达情况（图1A）。为了进一步确定，本研究采用Western blot验证了STC1在MDA-MB-231系列细胞系的条件培养液上清中的表达情况。由于抗STC1一抗无法与鼠源STC1相互作用，故4T1系列细胞系的STC1蛋白表达用Western blot未能检测到。进一步验证MCF10A系列细胞系（10AT、CA1h及CA1a）中STC1分泌蛋白的表达情况（图1B）。MCF10系列也是人源细胞系，其中MCF10AT（简称10AT）是人源乳腺癌细胞系，能在裸鼠上形成良性肿瘤；MCF10CA1h（简称CA1h）是能形成分化程度较高的肿瘤，且具有肺转移能力；MCF10CA1a（简称CA1a）能形成分化程度较低的肿瘤，且能通过尾静脉注射形成肺转移灶，其转移能力较强［22-23］。

高肺转能力细胞系4 173及4 175的STC1表达明显高于低肺转能力的231母系；高肺转能力细胞系CA1h及CA1a的STC1表达明显高于无肺转能力的AT。

图1 高肺转细胞系分泌高水平STC1蛋白Fig 1 Cell lines with high lung metastatic potential secreted more STC1 than those without metastatic ability

STC1在乳腺癌细胞系中的表达质谱数据以及Western blot数据显示，分泌蛋白STC1在高转移乳腺癌细胞系中的表达水平高于低肺转能力的细胞系。为了确定在mRNA水平上STC1是否也在高肺转系中高表达，本研究采用q RT-PCR法测定了STC1在MCF10系列、MDA-MB-231系列及鼠源4T1系列细胞系中的表达情况（图2）：STC1m RNA的表达水平与蛋白表达水平结果一致，在具有高肺转能力的细胞系CA1h、CA1a、4173、4175及4T1中的表达高于其他低肺转或无肺转能力的细胞系。

在患者样本中STC1与乳腺癌转移的关系在转移组乳腺癌患者中，STC1的表达达明显高于非转移组患者，差异有统计学意义（P=0.049，图3A）。另外，通过网上数据库（www.kmplot.com）分析了1 609例乳腺癌患者原位癌STC1的表达与乳腺癌患者预后发生转移的关系。原位癌高表达STC1的乳腺癌患者组发生转移的风险更大，差异有统计学意义（P=0.013，图3B）。

图2 qRT-PCR检测STC1 mRNA表达水平与乳腺癌细胞系的肺转移能力Fig 2 Expression level of STC1 mRNA correlated with lung tropism in breast cancer all lines detected by qRT-PCR

图3 乳腺癌患者肿瘤样本STC1的表达量与发生转移的风险正相关Fig 3 In breast cancer patients，the STC1 expression level in primary tumor samples correlates with metastasis risk

讨 论

研究表明，在癌细胞改造肿瘤微环境的过程中，癌细胞的分泌蛋白（包括细胞因子、生长因子、蛋白酶等）作用非常关键［24-25］。金属蛋白酶MMP1、MMP2是公认的对转移具有促进作用的癌细胞分泌蛋白［26］。癌细胞分泌的分泌蛋白不仅能改变肿瘤的微环境，而且能在癌细胞到达转移靶器官之前通过循环系统到达转移靶器官并改造靶器官，从而使其成为适于癌细胞生长的土壤［27］。分泌蛋白存在于癌细胞外，容易在血液或体液中被检测到，也容易通过药物进行靶向治疗。因此，肿瘤的分泌蛋白组学研究可以为肿瘤的早期诊断及靶向治疗提供重要依据，具有重要的临床应用价值。

通过液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）对比分析具有不同遗传背景及不同转移能力的乳腺癌细胞系的分泌蛋白组，我们发现了在高肺转移细胞系中高表达的分泌蛋白STC1。通过q RT-PCR及Western blot方法进一步验证了STC1在具有高肺转能力的细胞系中高表达。另外，通过网上数据库及患者样本检测，均发现STC1的表达与乳腺癌的转移能力相关。以上结果中提示乳腺癌STC1的表达与乳腺癌转移，特别是乳腺癌肺转移密切相关。因此，临床上有可能用STC1作为乳腺癌肺转移的一种分子标志进行预测。

肿瘤的分泌蛋白可被肿瘤细胞分泌到细胞外并存在于组织液中甚至血液中，这使分泌蛋白更容易被检测到并进行靶向治疗。本研究发现乳腺癌患者原位癌STC1的表达与乳腺癌预后发生肺转移风险具有一定的相关性。曾有报道提示分泌蛋白STC1也可以在血液中被检测到［13］。因此，在今后的研究中应进一步关注乳腺癌患者血液中分泌蛋白STC1的表达水平与患者预后发生转移的相关性，这可为临床上通过检测STC1的表达诊断及预防乳腺癌患者发生DMFS提供重要的理论依据。

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STC1 expression in breast cancer is correlated with breast cancer lung metastasis

LI Jia-tao，LI Hui，HU Guo-hong△
（Institute of Health Sciences，School of Medicine，Shanghai Jiao Tong University/Shanghai Institutes for Biological Sciences，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 200025，China）

ObjectiveTo investigate the expression of stanniocalcin 1（STC1）in breast cancer cell lines and its relationship with breast cancer metastasis.MethodsSTC1 protein expression in breast cancer cell lines was determined by Western blot and mass spectrum.STC1 mRNA expression in cell lines and 23 patient samples was determined by quantitative real-time PCR（qRT-PCR）.Kaplan-Meier curves for distant metastasis free survival in breast cancer patients were determined based on the analysis of STC1 expression of 1 609 breast cancer patients from online database.ResultsIn breast cancer cell lines，STC1 secretion in cell lines with lung metastatic potential was higher than those without lung tropism as determined by Western blot and mass spectrum.In breast cancer patients，STC1 mRNA expression in patients with higher risk of lung metastasis was more than patients without metastasis risk.Kaplan-Meier curves for distant metastasis free survival analysis of online database showed that breast cancer patients with high STC1 expression were more likely to have distant metastasis.ConclusionsSTC1 expression is correlated with breast cancer metastasis，and may be a potential biomarker for breast cancer lung metastasis.

STC1； breast cancer； metastasis； biomarker

R 737.9

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2015.05.010

2015-03-06；编辑：段佳）

△Corresponding author E-mail：ghhu@sibs.ac.cn