酶联免疫分析检测乙型肝炎e抗原的空白限、检出限及定量限的建立与评价*

胡 敏，杨泽华，赵克斌(山西医科大学第一医院医学检验科，太原 030001)



·论 著·

酶联免疫分析检测乙型肝炎e抗原的空白限、检出限及定量限的建立与评价*

胡 敏，杨泽华，赵克斌△(山西医科大学第一医院医学检验科，太原 030001)

目的 建立并评价酶联免疫分析手工操作检测HBeAg的空白限(LoB)、检出限(LoD)及定量限(LoQ)。方法 参照美国临床实验室标准化协会EP-17A文件和有关文献，结合工作实际，将HBeAg的空白样品及系列低浓度样品进行酶联免疫分析手工操作的检测，根据数据的分布规律，采用相应的统计学方法，建立酶联免疫分析手工操作检测HBeAg的LoB、LoD及LoQ并进行评价。结果 HBeAg的LoB为0.131 PEI U/mL，LoD为0.350 PEI U/mL，LoQ为0.450 PEI U/mL。结论 厂商声明的LoB得到验证，同时建立了实验室检测HBeAg的LoB、LoD和LoQ，为临床诊断和治疗提供更有价值的信息。

乙型肝炎e抗原； 酶联免疫吸附试验； 空白限； 检出限； 定量限

乙型肝炎e抗原(HBeAg)是乙型肝炎病毒(HBV)C基因转录生成的循环蛋白，与乙型肝炎表面抗原一样，是乙型肝炎(简称乙肝)的直接指征，它的持续阳性提示疾病慢性化，可能会进展为慢性活动性肝炎、肝硬化[1]。慢性乙肝患者接受干扰素或核苷酸类药物治疗时，血清HBeAg水平的高低直接反映患者的预后情况，因此HBeAg常用于评估乙肝抗病毒疗效及传染性强弱[2-3]。当今国内HBeAg检测方法和仪器种类繁多，如何确保检测系统间结果的可靠性成为当务之急[4]。本研究主要参照美国临床实验室标准化协会发布的《确定检出限值和定量限值方案》，对酶联免疫分析检测HBeAg的空白限(LoB)、检出限(LoD)和定量限(LoQ)进行建立和评价，旨在为临床提供更可靠的诊断信息[5]。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 酶联免疫分析手工操作，试剂(批号201406101)由上海科华生物工程股份有限公司提供；美国PerkinElmer Wallac 1235全自动时间分辨荧光免疫分析仪，试剂(批号8600021769)由苏州新波生物技术有限公司提供；美国雷勃Wellscan MK3酶标仪。

1.2 样品制备 收集PE公司1235全自动时间分辨荧光免疫分析仪检测HBeAg水平为0 PEI U/mL的健康人新鲜血清50例混匀作为空白样品，并检测证实此混合血清HBeAg水平为0 PEI U/mL；用空白样品对原始HBeAg样品作系列稀释，配置成系列低浓度HBeAg样品，其理论水平分别为0.15、0.25、0.35、0.45、0.55 PEI U/mL，介于LoB水平的1～4倍。所有样品均无溶血、无黄疸、无脂浊，分装于EP管中置-20 ℃冰箱保存。

1.3 方法

1.3.1 试验基本要求 试验前严格按照厂商操作规程对仪器进行维护、校准和质量控制，确认质量控制结果在控的前提下方可检测样品。

1.3.2 LoB的确定[6]对空白样品进行60次测定，每日1批，每批重复检测12次，共5 d，记录吸光度值A。按国际标准化组织，设定Ⅰ类错误与Ⅱ类错误水平均为5%，即α=β=5%，5%的α值相当于使用空白值分布的95%百分位数，作为显著高于空白的检测值的限值。若空白值呈正态分布，按以下公式计算LoB：LoB=μB+1.645σB，其中μB和σB分别是空白检测的均值和标准差。若空白值呈非正态分布，则用非参数方法估计第95%百分位数。将检测值依据大小排列，求相应的百分位数ρ=(100-α)=95，LoB=[nB(95/100)+0.5]位置的结果，式中nB为空白样品的重复检测次数，即nB=60。

1.3.4 LoQ的确定[6]依据临床要求和室间质量评价的允许误差，设定本实验室HBeAg的总误差目标为20%，在不考虑分析偏差的条件下，总误差=2CV，若低浓度样本的CV≤1/2TEa，则LoQ=LoD；若TEa大于实验室制订的质量目标20%，则需要选择更高浓度的定值样品重复检测。

2 结 果

2.1 标准曲线的建立 浓度为0、0.970、2.260、6.590、7.490、14.980 PEI U/mL的各样品其吸光度值分别为：0.005、0.169、0.643、1.512、1.899、2.552。将以上数据通过CurveExpert1.4进行曲线拟合，结果显示二次多项式拟合法的拟合程度最高，标准曲线见图1。

2.2 LoB的建立 空白样品的检测结果经正态性检验，呈非正态分布，因此用非参数方法估计LoB，即估计第95%百分位数，将60个空白值由小到大排序后第51～60位数值见表1，LoB在[60×(95/100)+0.5]=57.5位置的值，即LoB=(57号结果+58号结果)/2，第57.5位结果为(0.131+0.131)/2=0.131 PEI U/mL，即LoB为0.131 PEI U/mL。

图1 HBeAg浓度-吸光度曲线

秩号空白值秩号空白值510．128560．128520．128570．131530．128580．131540．128590．131550．128600．138

2.3 LoD的建立 系列低浓度样品测定结果见表2。60个低浓度样品检测结果呈非正态分布，使用非参数程序估计LoD，即LoD = LoB+Ds、β，其中Ds、β是低浓度样品测定值中位数的值和第5个百分位数值的间距。运用SPSS19.0计算，中位数为0.392 PEI U/mL，第5百分位数的值为0.173 PEI U/mL，Ds、β=0.392-0.173=0.219 PEI U/mL。LoD=LoB+Ds、β=0.131+0.219=0.350 PEI U/mL。

表2 系列低浓度样品测定结果

注：xi1和xi2为同一天内的2批测定结果。

表3 酶联免疫分析手工操作检测HBeAg低浓度样品的日间CV

2.4 LoQ的建立 本实验室依据临床需求及权威机构规定的分析质量要求设定酶联免疫分析手工操作检测HBeAg的总误差目标为20%，在不考虑分析偏差的情况下，TEa=2CV，即CV=1/2TEa。HBeAg浓度在0.450 PEI U/mL时检测的日间变异为8.95%，接近10.00%，符合质量目标要求，因此LoQ=0.450 PEI U/mL。见表3。

3 讨 论

HBeAg/HBeAb血清学转换是HBV复制下降的可靠标志，HBeAg阳性与否使慢性乙肝患者的临床经过和治疗应答效果有很大差别。但是任何定量试验均存在可接受的偏差，定性试验也必然存在一定的漏检率[7]。为了防止弱阳性标本的漏检，有效地提高检出率，各临床实验室可以科学地建立满足各实验室自己质量要求的检测限，将更准确的检测结果反馈给临床[8]。

LoB、LoD和LoQ是评价检测方法或检测系统灵敏性的重要参数，因此LoD与LoQ的设定是至关重要的，因为确定极微量的待测物质对于疾病的确定，尤其是传染性疾病的确诊具有很大意义[9]。EP17-A文件就如何确定临床检验方法的检测低限，如何基于实验室在低水平浓度处的性能目标确定定量检测限提出了建议。本研究严格按照EP17-A方案，建立了酶联免疫分析手工操作检测HBeAg的LoB为0.131 PEI U/mL，低于厂商说明书声明的灵敏度0.154 PEI U/mL，LoD为0.350 PEI U/mL，LoQ为0.450 PEI U/mL。使用酶联免疫分析手工操作检测HBeAg结果报告时，若HBeAg结果低于0.131 PEI U/mL，则报告“分析物未检出，浓度低于0.131 PEI U/mL”；若HBeAg结果高于0.131 PEI U/mL，低于0.350 PEI U/mL，则报告“有分析物检出，但不能准确定量，浓度小于0.350 PEI U/mL”；若HBeAg结果高于0.450 PEI U/mL，则直接报告检测结果。

已有研究证实，全自动酶免检测设备在过程处理的速度、灵敏度和精密度方面均优于手工操作，因其试验的全过程加样、加试剂、孵育、洗板、结果判读等均由电脑控制，消除了手工操作的人为误差，使得加样、加试剂准确，孵育时间严格控制，检测的灵敏度相应提高[10]。本科室已引入Addcare ELISA 1100全自动酶免疫分析系统及Beckman Coulter公司Power Express自动化流水线，全自动酶联免疫分析仪将成为酶联免疫实验室的主导设备，酶联免疫实验室的自动化与标准化是实现全实验室自动化的一部分。根据CNAS-CL02：2012《医学实验室质量与能力认可准则》的要求，设备在安装时及常规使用中应显示出能够达到规定的性能标准。以后作者将对Addcare ELISA 1100全自动酶免仪的分析性能进行系统、全面的评价[11]。

[1]Lang T,Lo C,Skinner N,et al.The hepatitis Be antigen(HBeAg)targets and suppresses activation of the toll-like receptor signaling pathway[J].Hepatol,2011,55(4):762-769.

[2]郝迎迎,夏娟,刘勇，等.血清HBeAg定量检测对慢性乙型肝炎患者核苷(酸)类似物治疗后e抗原血清转化的预测作用[J/CD].中华临床医师杂志：电子版,2012,6(11):2915-2920.

[3]万谟彬,翁心华.干扰素治疗慢性乙型肝炎专家建议[J].中华传染病杂志,2010,28(4):193-200.

[4]苏荣，叶桂样，罗娜，等.乙型肝炎病毒E抗原检测方法性能的初步评价[J].实验与检验医学,2013,2(31):21-23.

[5]NCCLS.EP-17A Protocols for determination of limits of detection and limits of quantitation;Approved guideline[S].Wayne,PA,USA:NCCLS,2004:1-39.

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[11]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL02 2012医学实验室质量和能力认可准则[S].北京：中国合格评定国家认可委员会，2012.

Establishment and evaluation of limit of blank,limit of detection and limit of quantitation for detection of HBeAg by enzyme-linked immunosorbent assay*

HUMin,YANGZe-hua,ZHAOKe-bin△

(DepartmentofClinicalLaboratory,FirstHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan,Shanxi030001,China)

Objective To establish the limit of blank(LoB),limit of detection(LoD) and limit of quantitation(LoQ) for the detection of HBeAg by the enzyme-linked immunosorbent assay.Methods Referring to CLSI EP-17A protocol and related literature,and by combining with our actual works,the blank sample and a series of low concentration samples were performed the ELISA detection by the manual operation.According to the distribution law of the data,the corresponding statistical method was adopted to establish the ELISA detection of LoB,LoD and LoQ of HBeAg by the manual operation.Results LoB of HBeAg measured by the manual operation was 0.131 PEI U/mL,LoD was 0.350 PEI U/mL and LoQ was 0.450 PEI U/mL.Conclusion The LoB of HBeAg stated by the manufacturer is verified.At the same time,LoB,LoD and LoQ of HBeAg detected by our laboratory are established,which provide more valuable information for the clinical diagnosis and therapy.

HBeAg; enzyme-linked immunosorbent assay; limit of blank; limit of detection; limit of quantitation

卫生部医药卫生科技发展研究中心资助项目(28-1-45)。

胡敏，女，硕士，初级检验师，主要从事检验方法学方面的研究。△

，E-mail：syyyjykzkb@sina.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.18.004

A

1672-9455(2015)18-2656-03

2015-04-10

2015-05-10)