凉血通瘀方对大鼠脑出血脑组织含水量及AQP-4表达的影响

李建军，马铁柱，梁 晋，孙世中，王 震

凉血通瘀方对大鼠脑出血脑组织含水量及AQP-4表达的影响

李建军1,2，马铁柱1，梁 晋1，孙世中1，王 震3*

目的 探讨凉血通瘀方对脑出血后脑水肿组织含水量及AQP-4表达的影响。方法 采用自体尾状核内注射方法制备大鼠脑出血模型。大鼠分为凉血通瘀方治疗组、脑出血模型组和假手术组。凉血通瘀方治疗组采用凉血通瘀方灌胃，其余组采用生理盐水灌胃。分别观察脑出血后12 h、1 d、2 d、3 d、5 d神经功能缺损评分、脑组织含水量。免疫荧光法及聚合酶链反应监测脑水肿组织AQP-4蛋白、AQP-4 mRNA表达水平。结果 凉血通瘀方治疗组和脑出血组在不同时间段内神经功能缺损均高于对照组，其脑组织含水量也高于对照组(P<0.05)。与脑出血组相比较，凉血通瘀方治疗组在脑出血后2、3、5 d时，AQP-4表达显著降低，在3、5 d后，大鼠AQP-4 mRNA表达显著降低。结论 凉血通瘀方能够降低脑水肿组织AQP-4的表达，从而减轻脑水肿。

脑水肿；凉血通瘀方；AQP-4

0 引言

脑出血是严重威胁人类健康的疾病之一，具有高发病率、高死亡率、高致残率的特点。脑出血后脑水肿是影响脑出血预后的关键因素。水通道蛋白(Aquaporin，AQP)属于高度选择性水通道特异蛋白家族，研究表明，水通道蛋白-4(AQP-4)是一类广泛分布于毛细血管周围星型胶质细胞足突的跨膜水通道蛋白，其在调节脑组织水的代谢中发挥关键作用，可能与脑水肿的发生发展密切相关[1]。研究发现，中药凉血通瘀方对减轻脑水肿具有明显的作用[2]。本研究观察凉血通瘀方对大鼠脑出血脑组织含水量及AQP-4表达的影响，从而为临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康雄性SD大鼠60只，鼠龄12～16周，体重250～300 g，由天津中医药大学动物实验中心提供。在实验前饲养大鼠1周，使大鼠适应实验室环境。随机分为假手术组(Sham-operated,SO)、脑出血模型组(Intracerebral henorrhage,ICH)和凉血通瘀方治疗组(Liangxue Tongyu Formula,LXTYF)。各组分别在脑出血手术后12 h、1 d、2 d、3 d、5 d进行神经功能缺损评分。在评分结束后处死大鼠，留取标本。模型建造后，根据神经功能缺损评分判断是否成功，若造模不成功则增补相应大鼠。

1.2 药品与试剂

1.2.1 药品 凉血通瘀方由水牛角、熟地黄、赤芍、生地黄、牡丹皮煎制、浓缩，每毫升药含量为1.2 g(由天津中医药大学药学院制剂室制备)。

1.2.2 试剂 大鼠单克隆抗体AQP-4系Santa Cruz公司产品，二步法抗兔/鼠通用型免疫组化检测试剂盒系购自天津优抗有限公司。RNA提取试剂盒、反转录试剂盒及PCR扩增试剂盒均购自TaKaRa宝生物工程(天津)有限公司。

1.3 动物模型制作 参照文献[3]制备动物模型，大鼠饲养1周，术前12 h禁食，4 h禁水。用10%的水合氯醛按400 mg/kg腹腔麻醉后，俯卧位于立体定位仪上固定。根据人卫版《大鼠脑立体定位图谱》[4]，头顶常规备皮，消毒，正中切口约10 mm，用30%H2O2腐蚀颅骨外膜，暴露前囟及冠状缝，于冠状缝前0.2 mm、中线向左旁开3 mm处，用手术刀片尖端处刻深达硬脑膜的1个小孔。断尾取自体血约50 μL。用微量注射器自钻孔处垂直进针，深度5.8 mm，匀速向尾状核内缓慢推注，速度约为2 μL/min。注完后停针约15 min后退针，钻孔处用骨蜡封闭，消毒并缝合切口。假手术组制备上述模型，在钻孔处注入30 μL生理盐水。实验后，各组动物自由进食食物和水，在相应时间点处死动物。神经功能评分用Longa评分法[5]，按不同分级记分：0级：无体征，记0分；1级：小鼠不能完全伸直其前肢，记1分；2级：小鼠一侧肢体瘫痪，有追尾现象，记2分；3级：小鼠不能站立或打滚，记3分；4级：无自发性活动，有意识障碍记4分。

1.4 药物干预 凉血通瘀方组大鼠造模成功后3 h灌胃，间隔24 h重复给药，1、2、3、5 d处死大鼠时分别给药1、2、3、5次。假手术组和模型组大鼠按相同方式给予生理盐水灌胃。

2 评价方法

2.1 测定脑组织含水量 采用干湿质量法[6]测量脑组织含水量，用电子天平(精确度0.l mg)分别测量实验组和对照组相应部位脑组织湿重。随后放入恒温(100 ℃)干燥箱烘24 h以上，至脑组织重量不再减轻为止，然后测其干重。按脑组织含水量=(脑组织湿重-脑组织干重)/脑组织湿重×100%，计算脑组织含水量。

2.2 AQP-4免疫组化染色 在相应时间点对各组大鼠进行神经功能缺损评分后处死，切片，随后将切片预热、脱蜡、脱水。脑组织切片脱蜡脱水后，按照试剂盒提供的步骤说明，采用免疫组化法检测脑组织AQP-4蛋白的表达。DAB染色，用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件进行分析，随机选取每只大鼠的1张脑切片，在400倍光镜下随机选取血肿周围的6个互补重叠的视野，对每个视野的阳性细胞数进行计数。

2.3 聚合酶链反应检测AQP-4 mRNA的表达 50 mg样品加入TRIzol试剂，提取总RNA。通过基因库查找基因序列，设计引物序列。AQP-4引物上游为5′-TGGTTCAGTGCTTCGGCCAC-3′；下游引物序列为5′-CCAGCAGTGAGGTTTCCATG-3′，扩增片段为219 bp。β-actinin上游引物为5′-CCACAGTCCATGCCATCACT-3′；下游引物序列为5′-TCCACCACCCTGTTGGTGTTAG-3′，扩增片段为430 bp。进行RT-PCR反应，反应条件：逆转录50 ℃ 30 min，逆转录酶失活94 ℃ 2 min，变性94 ℃ 45 s，退火57 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 2 min，末次循环后72 ℃延伸8 min。内参蛋白β-actinin反应条件同AQP-4。

3 结果

3.1 不同组别之间神经功能缺损评分比较 凉血通瘀方治疗组及脑出血模型组大鼠神经功能缺损评分明显高于假手术组(P<0.05)。凉血通瘀方治疗组大鼠术后3、5 d神经功能缺损评分明显低于脑出血模型组(P<0.05)。见表1。

3.2 不同组别造模后脑组织含水量比较 凉血通瘀方治疗组与假手术组比较，其在脑出血1、2、3、5 d时脑组织含水量明显增高(P<0.05)；与脑出血组比较，其脑组织含水量明显降低(P<0.05)。而与假手术组比较，脑出血模型组脑组织含水量较高(P<0.05)。见表2。

3.3 不同组别大鼠脑组织AQP-4表达比较 与假手术组比较，凉血通瘀方组和脑出血模型组脑组织AQP-4表达显著升高，与脑出血模型组比较，凉血通瘀方组在造模2、3、5 d时AQP-4表达显著降低，见表3。

表1 三组造模后不同时间神经功能缺损评分比较(分)

注：*与假手术组比较，P<0.05；#与脑出血模型组比较，P<0.05

表2 三组造模后不同时间脑组织含水量测定(%)

注：*与假手术组比较，P<0.05；#与脑出血模型组比较，P<0.05

表3 三组大鼠造模后脑组织AQP-4表达比较(个/HP)

注：*与假手术组比较，P<0.05；#与脑出血模型组比较，P<0.05

3.4 三组大鼠AQP-4 mRNA表达比较 与假手术组比较，脑出血模型组和凉血通瘀方组AQP-4 mRNA表达均升高(P<0.05)，造模后3、5 d，凉血通瘀方组低于脑出血模型组(P<0.05)。见表4。

表4 三组大鼠不同时间AQP-4 mRNA表达(个/HP)

注：*与假手术组比较，P<0.05；#与脑出血模型组比较，P<0.05

4 讨论

脑水肿是脑出血后疾病进展致死的主要原因之一[7]，脑水肿主要是由于脑组织内液体含量过多，导致脑容积增大从而产生一系列生理病理变化。研究发现，脑水肿与AQP-4密切相关[8]。AQP-4能够促进血管源性脑水肿中多余水分的再吸收，从而降低血管源性脑水肿的发生[9]。以往的研究显示，中药对于脑水肿改善起重要作用[10-11]。中药可能降低AQP-4的表达，从而促进神经功能的恢复及促进脑水肿恢复。

凉血通瘀方是著名老中医周仲瑛教授基于长期临床实践经验总结出的治疗出血性疾病急性期的基本方法。瘀热阻窍是出血性疾病中风期的基本病机。而凉血通瘀方具有凉血化瘀、通腑泄热的功效，能够针对瘀热阻窍起作用。何春燕等[12]研究显示，凉血通瘀方可以通过上调基质金属蛋白酶组织抑制剂1来抑制基质金属蛋白酶9的表达水平，从而减轻大鼠脑水肿。

本研究显示，凉血通瘀方治疗大鼠脑水肿具有明显效果，治疗后大鼠神经功能缺损程度明显减轻，脑组织含水量也明显降低。通过免疫组化和聚合酶链反应监测脑水肿组织AQP-4的表达，显示经过凉血通瘀方治疗的大鼠AQP-4表达显著降低，提示凉血通瘀方可能通过降低AQP-4的表达，从而减轻脑组织水肿。

[1] Manley GT,Fujimura M,Ma T,et al.Aquaporin-4 deletion in mice reduces brain edema after acute water intoxication and ischemic stroke[J].Nat Med,2000,6(2):159-163.

[2] 金妙文,周仲瑛,吴勉华,等.凉血通淤口服液治疗出血性中风疾病急性期瘀热阻窍症的临床研究[J].中国中西医结合急救杂志,2007,14(6):323-327.

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[4] 包新民,斯舒云.大鼠脑立体定位图谱[M].北京:人民卫生出版,1991:26-27.

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[10]李妍,崔向宁,陈泽涛,等.活血化瘀中药对脑出血大鼠脑组织含水量及AQP-4表达的影响[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(19):153-156.

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[12]何春燕,黄建华,王文健,等.凉血通瘀方对脑出血大鼠脑水肿及基质金属蛋白酶9金属蛋白酶组织抑制剂1表达的影响[J].中西医结合学报,2010,8(4):347-351.

Effect of liangxue tongyu foamula on brain edema and AQP-4 expression in rats with intracerebral hemorrhage

LI Jian-jun1,2,MA Tie-zhu1,LIANG Jin1,SUN Shi-zhong1,WANG Zhen3*

(1.Brain Hospital，Affiliated Hospital of The Armed Police Logistics College,Tianjin 300162,China;2.Graduate School of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China;3.Department of Medical Science,Affiliated Hospital of The Armed Police Logistics College,Tianjin 300162,China)

Objective To investigate the effect of liangxue tongyu foamula on brain edema and AQP-4 expression in rats with intracerebral hemorrhage.Methods Intracerebral hemorrhage was induced by injecting self-blood to the caudate nucleus to form the model rats.The rats were divided into liangxue tongyu foamula treatment group(treatment group),cerebral hemorrhage model group (model group) and control group.Rats in treatment group were intragastrically administered with liangxue tongyu foamula,and the other two groups were intragastrically administered with normal saline lavage.The neural function and the brain water content at 12 h,1 d,2 d,3 d,5 d after cerebral hemorrhage were observed.Cerebral edema AQP-4 mRNA and AQP-4 protein expression levels were monitored using immunofluorescence and polymerase chain reaction.Results Compared with control group,both treatment group and model group showed significant differences in the neurologic deficits and the brain tissue water content(P<0.05).Compared with model group,treatment group showed significant decrease in AQP-4 protein at 2,3,5 d after cerebral hemorrhage,AQP-4 mRNA expression decreased significantly in rats after 3,5 d.Conclusion Liangxue tongyu foamula could decrease the expression of AQP-4 in edema brain of rats with intracerebral hemorrhage,thus alleviate the symptom of brain edema.

Cerebral edema;Liangxue tongyu foamula;AQP-4

2014-08-09

1.武警后勤学院附属医院脑科医院，天津 300162；2.天津中医药大学研究生院，天津 300193；3.武警后勤学院附属医院医疗科，天津 300162

武警部队后勤科研项目(WJHQ2012-20)；武警后勤学院科研创新团队资助项目(WHTD201306)

10.14053/j.cnki.ppcr.201504002

*通信作者