消瘤平体内外对人宫颈癌HeLa细胞生长及凋亡相关蛋白的影响

付盈盈，司应明*，李 林，李瑞生

消瘤平体内外对人宫颈癌HeLa细胞生长及凋亡相关蛋白的影响

付盈盈1，司应明1*，李 林1，李瑞生2

目的 研究消瘤平体内外对人宫颈癌HeLa细胞生长的影响，以及对凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Fas和Survivin含量的影响。方法 常规培养HeLa细胞，加入不同浓度的消瘤平，MTT法分别检测培养3个时段后对细胞生长的影响。HeLa细胞接种于BALB/C-nu裸鼠，随机分为5组，阴性对照组、5-fu阳性对照组以及消瘤平3个剂量组，另设空白对照组，观察荷瘤裸鼠的一般状况。腹腔注射给药4周后，取瘤块和脾脏，称重计算抑瘤率和脾脏指数。取血，免疫组化法检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Fas、Survivin蛋白的含量。结果 消瘤平体内外均能抑制HeLa细胞的生长；体内可明显增加荷瘤裸鼠的脾脏指数；中、高剂量的消瘤平可促进Bax的表达，抑制Bcl-2和Survivin的表达，高剂量的消瘤平还促进Fas的表达。结论 消瘤平抗宫颈癌的作用机制与抑制HeLa细胞增殖，以及Bcl-2、Bax、Fas和Survivin基因蛋白诱导的凋亡有关。

消瘤平；HeLa细胞；增殖；凋亡；Bcl-2；Bax；Fas；Survivin

0 引言

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤，其发病率仅次于乳腺癌，并逐年上升，具有年轻化趋势[1]。目前，放、化疗及手术是恶性肿瘤的主要治疗方法[2-3]，但由于中晚期癌细胞的转移和扩散，放、化疗及手术治疗的效果并不理想；并且放化疗选择性差，会损伤正常的组织和细胞，其毒副作用常使患者难以忍受，从而放弃导致治疗失败[4]。中药在癌症的治疗中既能扶正以增强机体免疫能力，又能杀伤癌细胞，对机体的毒副作用较小[5]。因此，寻找不良反应小、对肿瘤细胞选择性高的天然抗肿瘤药物已成为重要研究目标。消瘤平是本实验室采用水煎法制得的糖浆剂，由柴胡、黄芩、党参、炙甘草、大枣、法半夏6味中药材组成，HPLC测得其主要成分黄芪苷含量为2.41 mg/mL，具有增强免疫功能和抗肿瘤的作用，在肿瘤辅助治疗中具有一定的应用前景。本试验试图研究消瘤平对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响及作用机制，以期为消瘤平治疗宫颈癌提供实验基础以及理论依据。

1 材料与仪器

人宫颈癌HeLa细胞株购于中国科学院上海细胞研究所。SPF级BALB/C-nu裸鼠，体重16～20 g，购于中国医学科学院上海实验动物繁殖中心，合格证号：SCXK(沪)2007-0005，饲养于SPF级无菌环境中，用高压灭菌处理的饮用水和饲料喂养。消瘤平为本实验室提取制备，批号：130411。胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)；RPMI 1640培养粉(Gibco公司)；5-Fu(天津金耀氨基酸有限公司)；MTT和胰蛋白酶(Sigma公司)；ELx800型酶联免疫检测仪(BIO-TEK公司)；CO2孵箱(JOUAN公司)；超净工作台(中国吴江市净化设备总厂)；倒置显微镜(日本Olympus公司)；Bc1-2、Bax、Fas和Survivin抗体(南京凯基公司)；其他试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1 细胞培养 人宫颈癌HeLa细胞株接种于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基(含1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素)中，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养传代，取处于对数生长期细胞弃去原培养液，以PBS洗涤1～2次，然后用胰蛋白酶消化，离心后加入新培养液，调整细胞浓度。

2.2 MTT法检测消瘤平对HeLa细胞增殖的抑制作用 将调整好浓度的HeLa细胞接种于96孔培养板中，每孔细胞数约为1×104个，每孔100 μL，培养24 h。加入不同浓度的消瘤平(用1 640培养液溶解，最终每组含消瘤平浓度分别为：10、20、40、80、160、320 μg/mL)，每个浓度设6个平行孔，于37 ℃、5% CO2培养箱中分别继续培养12、24、48 h后，每孔吸出100 μL上清弃去，加入5 g/L MTT 20 μL，4 h后，加入100 μL DMSO，微量振荡器振荡使充分溶解，于酶标仪490 nm处检测，按公式“(1-药物孔A值/对照孔A值)×100%”计算药物的体外生长抑制率，以剂量和抑制率绘制生长曲线。

2.3 裸鼠移植瘤模型的建立、分组及给药 将对数生长期的HeLa细胞配制成1×107/mL单细胞悬液。取4～6周龄的BALB/C-nu裸鼠，无菌下将细胞接种于右侧腋窝皮下，致瘤后，以瘤块移植传代，4代后可用于实验研究。取出皮下移植瘤，剪切后接种于裸鼠右侧腋窝皮下，待成瘤后将荷瘤裸鼠随机分成5组，每组6只，分别按以下剂量进行给药：阴性对照组灌胃生理盐水；5-Fu阳性对照组腹腔注射5-Fu 25 mg/kg；消瘤平低剂量组灌胃消瘤平20 mg/kg；消瘤平中剂量组灌胃消瘤平40 mg/kg；消瘤平高剂量组灌胃消瘤平80 mg/kg，每周给药3次，每次0.2 mL，各组均连续给药4周。

2.4 消瘤平对荷HeLa细胞裸鼠瘤块的生长和免疫器官的影响 末次给药24 h后，脱颈椎处死裸鼠，剥离瘤块和脾脏，分析天平称重，计算各组抑瘤率和脾脏指数。并取部分移植瘤组织经DEPC水处理后，置入冻存管中，保存于液氮瓶。

肿瘤抑制率(%)=[1-(治疗组平均瘤重/阴性对照组平均瘤重)]×100%

脾脏指数=脾脏重量(mg)/体重(g)

2.5 免疫组织化学法检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Fas、Survivin含量的变化 取“2.4”项下冻存的肿瘤组织，用10%的中性缓冲甲醛固定10～12 h，无水酒精脱水l h，重复3次，二甲苯透明化处理，于65 ℃以下浸蜡及包埋，切片。置60 ℃温箱中垂直烤片。切片脱蜡至水，加入3% H2O2于室温下灭活内源性酶；0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH=6.0)进行热修复抗原；5% BSA封闭液；再分别滴加Bcl-2、Bax、Fas、Survivin抗体，用PBS (pH=7.4)洗3次；滴加IgG，PBS (pH=7.4)洗3次；再滴加SABC，PBS (pH=7.4)洗4次，显色，HE染色，脱水透明，封片，显微镜下观察。采用Image.Pro Plus 6.0图像分析系统，计算积分吸光度值。

3 结果

3.1 对宫颈癌HeLa细胞增殖的抑制作用 将96孔板于显微镜下观察发现，对照组细胞生长旺盛，经消瘤平作用的细胞排列稀疏。MTT检测发现，不同浓度的消瘤平对HeLa细胞的生长均有一定的抑制作用，各浓度组细胞生长抑制率与同一板的空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，不同板之间，同一浓度组的抑制率随着作用时间的延长而增大。表明消瘤平体外可抑制HeLa细胞的生长，且抑制作用具有浓度和时间依赖性。见图1。

3.2 荷瘤裸鼠的一般情况 接种5 d后，可见接种部位有实性小结节，随后结节逐渐增大。给药期间，各组裸鼠的一般状态均良好、皮肤红润，给药组食欲和活动量与对照组无明显差异。

3.3 对荷瘤裸鼠移植瘤生长的抑制作用 25 mg/kg 5-Fu腹腔注射给药明显抑制荷瘤裸鼠瘤块生长，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.001)；消瘤平3个剂量(20、40、80 mg/kg)灌胃给药均可抑制裸鼠瘤质量的增加，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.001)，肿瘤抑制率具有浓度依赖性。见表1。

图1 消瘤平对HeLa细胞增殖的抑制作用

3.4 对荷瘤裸鼠脾脏指数的影响 5-Fu组荷瘤裸鼠的脾脏指数给药后明显降低，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；40、80 mg/kg剂量消瘤平可明显增加荷瘤裸鼠的脾脏指数，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)，差异有统计学意义。见表1。

表1 消瘤平对荷瘤裸鼠瘤质量、脾脏指数的影响(n=6)

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

3.5 对凋亡相关基因蛋白Bcl-2、Bax、Fas、Survivin表达的影响 与对照组相比，5-Fu可显著促进Bax的表达(P<0.01)，抑制Survivin的表达(P<0.05)，差异有统计学意义；中、高剂量组的消瘤平可明显促进Bax的表达，抑制Bcl-2和Survivin的表达，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；高剂量组的消瘤平还可促进Fas的表达。见表2。

表2 消瘤平对荷瘤裸鼠Bax、Bcl-2、Fas、Survivin蛋白表达的影响

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

4 讨论

宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率均很高。近年来，天然药物在肿瘤治疗过程中具有显著成效，除了减轻放化疗导致的毒副反应，还提高肿瘤患者的生活质量，延长生存期[6]。大多数药物主要通过两种途径达到抗肿瘤的作用，即抑制细胞增殖和诱导凋亡[7]。而抑制细胞增殖的作用又和机体的免疫机制有密切关系[8]。消瘤平由柴胡、黄芩、党参、炙甘草、大枣、法半夏6味中药材组成。柴胡和解少阳，疏肝解郁，升举阳气，通达表里；党参和大枣补中益气，党参健脾益肺，大枣养血安神；黄芪健脾益气，驱风运毒；法半夏调和肝胃(脾)，炙甘草调和诸药，提高免疫功能。同时，柴胡归属肝经，可调节肝经的功能以助生血[9-10]。本实验采用MTT法检测消瘤平体外对宫颈癌HeLa细胞增殖的抑制作用，以及在移植瘤模型裸鼠体内对HeLa肿瘤的作用，结果表明，消瘤平体内外均能抑制HeLa细胞，这种抑制作用具有剂量依赖性；消瘤平还增加荷瘤裸鼠的脾脏指数，表明其抗宫颈癌的作用与提高荷瘤机体免疫功能有一定关系。

细胞凋亡是细胞在外界环境的影响下，为了更好地适应环境，在一系列基因的调控下进行的主动自杀过程，是维持机体自身稳定重要的调节机制，与肿瘤的发生、发展联系紧密[11]。在正常生物体内，细胞增殖和凋亡处于平衡状态，这种平衡一旦被打破，就会造成包括肿瘤在内的各种疾病的发生。近年来，随着对细胞因子研究的不断发展，在凋亡发生过程中一些特定的基因起着举足轻重的作用，其与肿瘤的发生、发展及预后的关系也成为研究的热点[12]。

Bcl-2家族基因广泛分布于生物体内，其表达的Bcl-2蛋白家族包括抑制细胞凋亡的抗凋亡蛋白Bcl-2和促进细胞凋亡的促凋亡蛋白Bax。Bcl-2是由239个氨基酸组成的蛋白质，在肿瘤组织中高度表达，但也表达于某些正常组织如黏膜细胞和淋巴细胞等。Bcl-2可通过改变线粒体膜巯基的氧化还原状态，控制其膜电位以调控细胞凋亡[13-14]。当细胞受到死亡信号刺激后，Bcl-2家族中的促凋亡蛋白Bax在蛋白酶作用下发生结构变化，与Bcl-2形成异源二聚体，从而抑制Bcl-2，使其丧失抑制凋亡的作用，引起细胞器功能丧失和各种促凋亡因子的释放，最终导致细胞凋亡[15]。Bcl-2/Bax比例失调是肿瘤发生的原因之一。Fas属于TNF和NGF跨膜受体超家族成员，广泛分布于人体组织中，在与其受体Fasl/CD95L结合后导致空间构象发生改变，并可诱导激活诱导Caspase家族，启动蛋白级联反应，引起细胞凋亡[16]。Survivin是凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族的成员，含有一个BIR结构域，可与纺锤体微管蛋白特异性结合抑制细胞凋亡[17]。Survivin在大多数肿瘤组织内高表达，而在健康人的机体组织中并不存在。Survivin能干扰Fas、Bax、Caspase等因子诱导的凋亡，从而发挥抗凋亡功能。

本研究发现，消瘤平中、高剂量组可明显促进Bax的表达，抑制Bcl-2和Survivin的表达，而高剂量组的消瘤平还可促进Fas的表达。综上，可以推测消瘤平抗宫颈癌的作用与抑制HeLa细胞增殖、提高机体免疫功能和诱导细胞凋亡有关，而诱导凋亡的作用又与Bcl-2、Bax、Fas和Survivin有密切关系，细胞凋亡信号通路十分复杂，可能还涉及其他的凋亡基因蛋白，尚需进一步研究。

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Effect of Xiao liuping on human cervical carcinoma HeLa cells growth and apoptosis-related proteinsinvivoandinvitro

FU Ying-ying1,SI Ying-ming1*,LI Lin1,LI Rui-sheng2

(1.Xiangyang Hospital of Traditional Chinese Medicine,Xiangyang 441000,China; 2.Xiangyang Central Hospital,Xiangyang 441021,China)

Objective To investigate the effect of Xiao liuping on growth and the apoptosis-related protein Bcl-2,Bax,Fas and survivin content of human cervical carcinoma HeLa cells.Methods Cells were cultivatedinvitro,HeLa cells in culture mediuminvitrowere given with different concentrations of Xiao liuping,the inhibitory rate of the cells was measured by MTT assay.HeLa cells were seeded in BALB/C-nu mice,the tumor-bearing nude mice were divided into 5 groups randomly: control group,5-Fu group,Xiao liuping three doses groups,and the blank control group was set,the general condition of nude mice was observed.After 4 weeks,the tumor and spleen weight was determined,the tumor-inhibition rate and spleen index were calculated.The expression of apoptosis-related proteins Bcl-2,Bax Fas and Survivin in blood were determined by immunohistochemistry.Results Xiao liuping inhibited the proliferation of HeLa cellsinvitroandinvivo,increased the spleen index of nude mice significantly,the medium and high doses of Xiao liuping promoted the expression of Bax,and inhibited the expression of Bcl-2 and Survivin,high dose of Xiao liuping promoted the expression of Fas.Conclusion The anti-tumor mechanism of Xiao liuping related to the inhibition of the proliferation,as well as Bcl-2,Bax,Fas and Survivin induced apoptosis.

Xiao liuping; HeLa; Proliferation; Apoptosis; Bcl-2; Bax; Fas; Survivin

2014-08-28

1.襄阳市中医医院，湖北 襄阳 441000，2.襄阳市中心医院，湖北 襄阳 441021

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201504005