VEGF-B通过ERK1/2信号通路对RGC-5细胞缺氧损伤的保护作用*

刘玉洁 牟莉 李明新

(1.徐州医学院研究生学院2012级，江苏徐州221004;2.徐州医学院附属医院眼科，江苏徐州221002)

VEGF-B通过ERK1/2信号通路对RGC-5细胞缺氧损伤的保护作用*

刘玉洁1牟莉2李明新2

(1.徐州医学院研究生学院2012级，江苏徐州221004;2.徐州医学院附属医院眼科，江苏徐州221002)

目的探讨血管内皮生长因子B(vascular endothelial growth factor-B，VEGF-B)对氯化钴(cobalt chloride hexahydrate，CoCl2)诱导的大鼠视网膜神经节细胞株(retinal ganglion cells-5，RGC-5)缺氧损伤的保护作用及其机制。方法CoCl2孵育RGC-5细胞24h诱导缺氧模型。将RGC-5细胞分为正常组、缺氧组、VEGF-B+缺氧组、PD98059(ERK1/2阻滞剂，PD)+VEGF-B+缺氧组。倒置显微镜观察细胞的形态变化;CCK-8法检测细胞存活率;流式细胞仪Annexin V-APC/7-AAD双染色法检测细胞凋亡率;Western Blot检测蛋白Bcl-2、Bax及ERK1/2、p-ERK1/2表达水平。结果①缺氧使细胞皱缩变小变圆，正常组及药物组细胞体积大有突起。②与正常组相比，缺氧使细胞存活率减低;与缺氧组相比，药物组细胞存活率均升高。③与正常组相比，缺氧组正常细胞率下降、细胞凋亡率升高;与缺氧组相比，药物组正常细胞率升高、细胞凋亡率下降。④与正常组相比，缺氧组Bcl-2、Bcl-2/Bax比值降低，Bax增多;与缺氧组相比，药物组Bcl-2、Bcl-2/Bax比值增高，Bax减少。四组总ERK1/2表达量不变，p-ERK1/2表达量缺氧组较正常组增多，VEGF-B+缺氧组较缺氧组表达量高，PD+VEGF-B+缺氧组较VEGF-B+缺氧组减少。结论VEGF-B部分通过ERK1/2信号通路增加Bcl-2表达，降低Bax表达从而抑制CoCl2诱导的RGC-5细胞凋亡。

VEGF-B;RGC-5细胞株;缺氧损伤;凋亡;ERK1/2信号通路

视网膜神经节细胞等神经元细胞的损伤及凋亡是眼科常见的缺血缺氧性视神经视网膜疾病的共同的病理过程。低氧往往会引起神经元细胞的损伤及凋亡，造成视网膜缺血坏死进而导致视力下降甚至失明。采取有效的神经保护性治疗对恢复缺血缺氧性视网膜疾病患者视力，减少及逆转视神经的损伤具有重要意义［1］。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)具有促进血管形成和神经保护等多种生物学功能，VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、PIGF。近年来研究发现，VEGF家族蛋白可以直接作用于神经元或神经节细胞发挥保护作用［2］。但是由于VEGF促进血管形成和增加血管通透性的作用较强，限制了其在神经保护方面的作用［3-4］。

血管内皮生长因子B(vascular endothelial growth factor-B，VEGF-B)是VEGF家族成员中唯一能够保护神经细胞，而不诱导血管形成和血管通透性增加的因子，在正常生理状态下的生物学效应几乎可以忽略。张水华等［5］利用显微镊夹持视神经造成视神经横断性损伤模型证实VEGF-B对视神经具有保护作用，但具体的作用机制尚不清楚。基于大鼠视网膜神经节细胞株(retinal ganglion cells-5，RGC-5)与视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCS)表达物质、分子机制及对视神经保护剂反应的一致性［6-7］，目前国内外关于VEGF-B视神经保护作用具体分子机制的研究均应用RGC-5［8-12］。已有实验证实氯化钴(Cobalt chloride hexahydrate，CoCl2)可以诱导RGC-5凋亡且其作用24h的LD50为400μmol/L［13-14］。因此，本实验在此基础深入研究VEGF-B对RGC-5缺氧损伤保护作用的具体信号通路，从而为临床缺氧性视神经损伤疾病的治疗提供新的思路及理论依据。

1 材料和方法

1.1 主要材料大鼠RGC-5细胞株(American Type Culture Collection，ATCC，美国);VEGF-B(Peprotech，美国);氯化钴(sigma公司，美国);MEM (Minmum Essential Medium，MEM)培养基及胎牛血清(Gibco，美国)，Cell Counting Kit(CCK8)细胞增殖-毒性检测试剂盒(日本同仁化学研究所);SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂盒(碧云天);兔来源Bcl-2抗体、鼠来源Bax抗体(Santa Cruz，美国);兔来源ERK1/2、p-ERK1/2抗体(Cell Signaling，美国)，辣根过氧化物酶标记二抗(中杉金桥生物公司，北京)。

1.2 方法

1.2.1 RGC-5细胞培养、缺氧模型的建立及实验分组RGC-5细胞用含10%胎牛血清的MEM培养基(内加100 U/m l青链霉素)，于37℃、5%CO2，湿度90%的培养箱中培养。取生长状态良好的细胞用于实验，加入CoCl2溶液(使其终浓度为400μmol/L)作用24 h建立RGC-5细胞缺氧凋亡模型［14］。将RGC-5细胞分为正常组、缺氧组、VEGF-B+缺氧组、PD+VEGF-B+缺氧组。正常组细胞只加等量PBS作为对照;缺氧组加入CoCl2培养24 h;VEGF-B+缺氧组加入VEGF-B(终浓度100 ng/m l)预培养6h后［12］，再加入CoCl2继续培养24 h;PD+VEGF-B+缺氧组加入PD98059(终浓度20μmol/L)预培养1h后，加入VEGF-B预培养6 h后，再加入CoCl2继续培养24 h。

1.2.2 CCK8检测细胞存活率将RGC-5细胞以5000个/孔的细胞密度接种于96孔培养板内，每孔加入100μl含10%胎牛血清的培养基，37℃孵育24 h使细胞贴壁，换1.5%胎牛血清的培养基饥饿处理使细胞同步，予以相应处理后弃培养基，在每孔中加入100μl 1.5%培养基和10μl CCK-8试剂，继续于孵育箱内培养1～2 h，用酶标仪检测波长为450 nm处的吸光度值(OD值)，最后计算各组细胞存活率。细胞存活率=实验组吸光度值/正常组吸光度值× 100%［11］。

1.2.3 Annexin V-APC/7-AAD双染色法检测细胞凋亡率将细胞以一定密度接种于6孔板内，按分组培养制备各实验组细胞。予以相应处理后，用0.5 ml不含EDTA的胰酶消化细胞，1000 r/min离心5 min，弃上清。0.5ml PBS重悬细胞后，1000 r/min离心5 min，弃上清。向各组细胞中加入500μl的1× Binding Buffer重悬细胞后各加入5μl Annexin VAPC混匀，室温避光20～30 min，1000 r/min离心5 min，弃上清。向各组细胞中加入500μl的1×Binding Buffer重悬细胞后加入5μl 7-AAD混匀，冰上避光保存。1 h内于流式细胞仪进行上机检测。分析计算各组细胞的早期凋亡率+晚期凋亡率作为总的凋亡率［15-16］。

1.2.4 Western Blot检测Bcl-2、Bax、ERK1/2、p-ERK1/2的蛋白表达将细胞以一定密度接种于10cm皿内，予以相应处理后提取细胞蛋白提取液。按BCA法测定蛋白浓度后，取等量蛋白样品经10% -12%SDS-PAGE分离后，以湿转法电转移至PVDF膜上。转移后的PVDF膜经5%脱脂奶粉封闭3 h后，分别加入一抗(抗Bcl-2、Bax抗体1∶500稀释、抗p-ERK抗体1∶1000稀释，抗ERK抗体1∶2000稀释)，4℃过夜，洗膜5 min/次×3次;分别加入相应辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1～2 h后，洗膜5 min/次×5次。显影液中达到条带显色清晰后，用双蒸水洗涤终止反应放入定影液中定影，双蒸水洗涤终止反应后晾干胶片。计算机扫描条带，蛋白表达水平分别以免疫印迹中相应区带的灰度值相对于正常组的倍数表示。

1.3 统计学处理所得数据用均数±标准差(¯x± s)表示，应用Graphpad Prism 5.0软件进行统计分析。多组数据间比较用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，多组数据间两两比较用q检验。P≤0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 倒置显微镜下观察各组细胞的形态变化倒置显微镜下观察发现，正常组和VEGF-B+缺氧组细胞体积大，有突起从胞体伸出，缺氧组细胞皱缩变圆，体积明显变小;与缺氧组相比，PD+VEGF-B+缺氧组细胞体积大，突起多(图1)。

图1 倒置显微镜下各组细胞的形态学特点(×200)

2.2 CCK-8检测细胞存活率与缺氧组比较，正常组、VEGF-B+缺氧组、PD+VEGF-B+缺氧组较缺氧组在450 nm处OD值增加(表1)。与正常组相比，缺氧组细胞存活率减低;与缺氧组比较，VEGF-B +缺氧组、PD+VEGF-B+缺氧组细胞存活率升高;与VEGF-B+缺氧组相比，PD+VEGF-B+缺氧组细胞存活率减低，差异均有统计学意义(P＜0.05)(图2)。

表1 VEGF-B及PD98059对CoCl2诱导的RGC-5细胞存活率的影响

表1 VEGF-B及PD98059对CoCl2诱导的RGC-5细胞存活率的影响

注:与正常组比较*P＜0.001;与缺氧组比较#P＜0.05，###P＜0.001;与VEGF-B+缺氧组比较＆P＜0.05。

组别吸光度值(A450) 0.973±0.030缺氧组0.480±0.025*VEGF-B+缺氧组0.742±0.064*###PD+VEGF-B+缺氧组0.615±0.052*#＆正常组

图2 CCK8检测各组细胞存活率

2.3 Annexin V-APC/7-AAD双染色法检测细胞凋亡率流式细胞仪检测结果显示，正常组、VEGF-B +缺氧组及PD+VEGF-B+缺氧组细胞凋亡率均较低，缺氧组细胞凋亡率增加(图3A)。正常组、VEGF-B+缺氧组及PD+VEGF-B+缺氧组正常细胞率［(96.97±0.34)%、(91.03±0.97)%、(86.97±0.69)%］，与缺氧组［(81.50±1.37)%］比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)(图3B)。正常组、VEGF-B+缺氧组及PD+VEGF-B+缺氧组的细胞凋亡率［(2.12±0.47)%、(6.01±0.35)%、(9.43±0.51)%］，与缺氧组［(15.03±1.51)%］比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)(图3C)。

图3 A各组细胞流式细胞检测像

图3 B流式细胞仪检测各组正常细胞率

图3 C流式细胞仪检测各组细胞凋亡率

2.4 Western Blot检测Bcl-2、Bax、ERK1/2、p-ERK1/2的蛋白表达

与正常组相比，缺氧组Bcl-2表达减少，Bax表达增多，Bcl-2/Bax比值降低;与缺氧组相比，VEGFB+缺氧组及PD+VEGF-B+缺氧组Bcl-2表达增多，Bax表达减少，Bcl-2/Bax比值升高;与VEGF-B +缺氧组相比，PD+VEGF-B+缺氧组Bcl-2表达减少，Bax表达增多，Bcl-2/Bax比值降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)(图4)。与正常组相比，缺氧组p-ERK1/2表达量增加;与缺氧组相比，VEGF-B +缺氧组及PD+VEGF-B+缺氧组p-ERK1/2表达量增加;与VEGF-B+缺氧组相比，PD+VEGF-B+缺氧组p-ERK1/2表达量减少，差异均有统计学意义(P＜0.05)(图5)。四组总的ERK1/2表达水平不变。

3 讨论

RGCS是缺氧性视神经损害的主要细胞，因此，研究RGCS的分子机制对预防和治疗缺氧性视神经损害有重要意义，但原代培养的RGCS不能传代且生存时间短，限制了它在基础研究领域的应用。建立永久的转基因RGCS对于研究RGCS存活和再生的凋亡机制及生长因子变化至关重要。RGC-5是2001年Krishnamoorthy等通过转染技术建立的鼠RGCS系，该细胞克隆与RGCS的表型非常相似，而且该细胞系的一个很大优点是具有无限分裂能力［17］。除了形态及电生理与正常的RGCS不同外，RGC-5细胞膜、细胞内表达物质及细胞内分子机制与RGCS一致［6，18］。

RGC-5细胞系已被应用建立了多种凋亡模型，研究发现RGC-5在凋亡时的基因变化以及对神经保护剂的反应都与RGCs一致［19］。国外有研究用谷氨酸盐诱导法或剥夺血清法诱导RGC-5细胞凋亡，结果发现caspase-3、caspase-8及促凋亡蛋白Bax表达增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少［20-21］。此外，有研究［22］表明在体内可以诱导RGCS凋亡的同型半胱氨酸同样可以引起RGC-5细胞凋亡，而且这种毒性可以被神经保护剂阻断，说明RGC-5细胞系在凋亡模型中分子机制与RGCS一致。Maher等［23］在用三种氧化性物质诱导氧化应激损伤中发现RGC-5细胞凋亡有着共同特点，加入中枢神经保护剂对RGC-5具有保护作用。从而进一步证明:可以用RGC-5细胞系来研究氧化应激损伤导致的RGCs凋亡机制并且鉴定药物的神经保护作用。因此，对于研究RGCS细胞内的损伤与修复的分子机制来说RGC-5是很好的模型，目前国内外关于VEGF-B视神经保护作用具体分子机制的研究均应用RGC-5［8-12］，尤其对于研发视神经保护剂方面是很可行的。

张水华等［5］利用显微镊夹持视神经造成视神经横断性损伤模型，向视神经损伤模型小鼠的玻璃腔内注射重组人VEGF-B蛋白，其视网膜神经节细胞数量是单纯视神经损伤组和损伤加玻璃体腔内注射的阴性对照组的1.7倍和1.9倍。由此证明VEGF-B对外伤引起的视网膜神经节细胞具有修复作用，从而证实VEGF-B可以保护视神经。另外，离体实验研究［12］报道，在缺氧或过氧化诱导的RGC-5凋亡模型中，VEGF-B能抑制细胞的凋亡发挥视神经节细胞保护作用，与在体实验结果一致，但是未能具体阐明VEGF-B发挥抗凋亡作用的具体信号通路，而信号通路可能是药物临床应用的作用靶点。因此，本实验在此基础上深入研究VEGF-B对RGC-5缺氧损伤保护作用的具体信号通路，从而为临床治疗缺氧性视神经疾病提供新的靶点、理论基础及实验依据。

图4 Western Blot法检测各组细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达

图5 Western Blot法检测信号通路蛋白ERK1/2、p-ERK1/2的表达

本实验通过细胞存活率检测及流式细胞凋亡率检测发现，CoCl2诱导RGC-5细胞缺氧损伤后，细胞体积变小皱缩变圆;细胞存活率明显下降，凋亡率明显升高。而VEGF-B预处理后细胞存活率明显上升，凋亡率明显下降。证实VEGF-B对RGC-5细胞缺氧损伤的保护作用是通过抑制细胞凋亡来实现的。Li Yang等［12］研究证实VEGF-B抑制RGC-5细胞凋亡主要通过抑制BH3-only蛋白基因，本研究证实VEGF-B除了作用于BH3-only蛋白基因，还与凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax有关。Bcl-2是从小鼠B淋巴细胞瘤中分离得到的原癌基因，大量研究证实Bcl -2是最重要的一组调节基因。本实验发现VEGFB通过增加RGC-5细胞缺氧损伤后抗凋亡蛋白Bcl-2表达，降低促凋亡蛋白Bax表达发挥抗凋亡作用，而VEGF-B的抗凋亡作用被ERK1/2阻滞剂PD98059部分阻断。另外，四组总的ERK1/2表达不变;p-ERK1/2表达量缺氧组比正常组增加，VEGF -B+缺氧组比缺氧组表达量更高，而PD+VEGF-B +缺氧组p-ERK1/2表达量较VEGF-B+缺氧组下降。提示VEGF-B部分通过ERK1/2信号通路减轻CoCl2诱导RGC-5细胞凋亡发挥保护作用。

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3Ks)及丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)参与增殖、分化、凋亡等多种细胞功能的调节，是目前研究较为深入的两大信号通路家族［24-25］。目前，已在哺乳动物细胞克隆和鉴定了细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、JNK、p38和ERK5/ BMK1这4个MAPK亚族，ERK是首先被发现的MAPK信号通路，可被有丝分裂原、生长因子、血清、G蛋白偶联受体的配体和转录因子等激活，调控细胞的增殖和分化。ERK包括了两种异构体ERK1和ERK2(分别为P44和P42)。目前认为，P38和JNK属于“应激诱导”的MAPK，而ERK被认为是与细胞增殖、转化和分化相关的MAPK。P-ERK1/2是ERK1/2的活性形式，正常生理状态下ERK1/2磷酸化水平很低，当受到刺激如缺氧损伤等后，ERK1/2磷酸化水平升高发挥保护作用，而VEGF-B预处理后ERK1/2磷酸化水平更高提示VEGF-B与其受体结合后通过ERK1/2信号通路发挥保护作用。

本实验发现在RGC-5细胞系中，VEGF-B通过部分激活ERK1/2信号通路发挥抗凋亡作用，信号通路的复杂性提示我们VEGF-B或许还通过其他信号通路发挥保护作用。至于VEGF-B发挥保护作用具体通过几条信号通路以及何者起到主要作用，它们之间的交互作用(cross-talk)如何都有待于进一步深入研究。细胞培养的模型比动物实验有着特殊的优势，影响因素比较单一，且可人为控制，非常适合药物作用机制的研究。另外体外单独培养RGC-5细胞，没有血管内皮细胞的参与，说明VEGF-B可以直接作用于视神经元细胞而不通过周围的血管系统实现视神经保护作用。而在体实验多受内分泌、免疫系统等内环境影响，较适合考察药物对机体实际疗效和安全性。本实验较在体实验的不足在于未能证实在体视神经损伤动物模型中VEGF-B视神经保护作用的具体信号通路与细胞实验的结果是否一致，但是却为下一步实验研究指出一个方向。如果结果是肯定的，或许能够为VEGF-B治疗缺氧性视神经疾病提供新的治疗靶点及其理论基础和实验依据。

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Vascu lar endothelial grow th factor B alleviates hypoxia in jury in RGC-5 cell line，via ERK1/2 signaling pathway

LIU Yu-jie1MU Li2LIMing-xin2
(Grade 2012，Graduate School，Xuzhou Medical College，Xuzhou 221004，China; 2.Dept.of Ophthalmology，Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Xuzhou 221002，China)

Objective:To expore the protective effectsand the underlyingmechanism of vascular endothelial growth factor-B(VEGF-B)in retinal ganglion cells line(RGC-5)in rats with hypoxia injury induced by cobalt chloride hexahydrate (CoCl2).Methods:RGC-5 were incubated with CoCl2to induce hypoxia injury as the apoptosismodel.RGC-5 were divided into four groups:normal group，hypoxia group，VEGF-B+Hypoxia group and PD98059(inhibitor of ERK1/2，PD)+ VEGF-B+Hypoxia group.Themorphology of cellswas observed by inverted microscope.The cell viability rate was detected by CCK-8 assay.Annexin-V APC/7-AAD double staining flow cytometry was used to test the normal cells rate and apoptotic cells rate.The levels of Bcl-2，Bax，EKK1/2 and p-ERK1/2 protein expression were detected by using Western Blot.Results:①The morphology of cells in the normal group and VEGF-B+Hypoxia group were big and with many processes.The cells of the hypoxia group shrinked to be round and smaller.②The cell viability was decreased by CoCl2treatment compared with the normal group.VEGF-B treatment significantly increased cell viability compared with the hypoxia group.③The normal cells rate decreased and the apoptotic cells rate increased in the hypoxia group compared with the normal group.VEGF-B treatment significantly increased normal cells rate and decreased apoptotic cells rate compared with the hypoxiagroup.④Compared with the normal group，Bcl-2 protein expression and Bcl-2/Bax ratio decreased and Bax protein expression increased in the hypoxia group.However，VEGF-B treatment up-regulated Bcl-2 protein expression and Bcl-2/Bax ratio and down-regulated Bax protein expression compared with the hypoxia group.Moreover，hypoxia treatment up-regulated level of p-ERK1/2 protein compared with Normal group.Level of p-ERK1/2 protein was higher in VEGF-B+Hypoxia group compared with the hypoxia group but there was no change of total ERK1/2 protein expression in the four groups.Conclusion:VEGF-B can inhibit apoptosis induced by CoCl2inRGC-5 cell line through up-regulating Bcl-2 protein expression and down-regulating Bax protein expression，partially via ERK1/2 signaling pathway.

VEGF-B;retinal ganglion cells;hypoxia injury;apoptosis;ERK1/2 signaling pathway

R774

A

1004-7115(2015)09-0961-06

10.3969/j.issn.1004-7115.2015.09.001

2015-03-18)

刘玉洁(1985—)，女，河北石家庄人，硕士研究生，研究方向:眼底病。

牟莉，E-mail:xzfym l@163.com。