乙型肝炎病毒c抗原特异性T细胞系的建立及CTL克隆的筛选

洪 宇

(辽东学院医学院病原生物教研室，辽宁丹东 118003)

·经验交流·

乙型肝炎病毒c抗原特异性T细胞系的建立及CTL克隆的筛选

洪 宇

(辽东学院医学院病原生物教研室，辽宁丹东 118003)

目的 建立乙型肝炎病毒(HBV)抗原特异性T细胞系，并筛选得到抗原肽特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)克隆。方法 通过流式细胞染色方法鉴定出1例急性乙型肝炎患者的人类白细胞分化抗原(HLA)为HLA-A2型，分离患者外周血单个核淋巴细胞(PBMCs)；用重组人HBV c抗原(HBcAg)刺激PBMCs建立抗原特异性T细胞系；用HBcAg抗原肽刺激和有限稀释方法，筛选出HBcAg抗原肽特异性CTL克隆；以固相酶联免疫斑点技术(ELISPOT)和乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒试验对HBcAg特异性T细胞系和CTL克隆进行功能鉴定。结果 建系后HBcAg特异性T细胞明显得到富集，有限稀释后获得15株CTL克隆，其中14株表现出明显的HBcAg抗体肽特异性，包括抗原肽Core18-27特异性CTL克隆8株，抗原肽Core107-115特异性CTL克隆4株，另外2株CTL克隆对2条HBcAg抗原肽有交叉反应性。结论 成功建立HBcAg抗原特异性T细胞系和CTL克隆，为后续试验奠定基础。

肝炎病毒，乙型；T淋巴细毒，细胞毒性；T淋巴细胞；肝炎核心抗原，乙型

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染的治疗情况，通常取决于病毒与机体免疫系统的相互作用情况。HBV特异性细胞免疫反应，特别是抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)是机体抵抗HBV感染，清除病毒的中坚力量。诸多文献报道乙型肝炎的慢性化与HBV特异性T细胞特别是CTL的免疫功能耗竭密切相关[1-2]。由于HBV宿主范围狭窄，难以建立合适的HBV感染动物模型，所以构建HBV抗原特异性细胞系和CTL克隆成为研究病毒与宿主免疫系统相互的重要途径之一。另外，过继性细胞免疫治疗的设想被提出[3-4]，也赋予HBV抗原特异性CTL克隆尤其是具备优势抗原表位的CTL克隆极具潜力的临床应用价值。本研究通过重组人乙型肝炎核心抗原(HBcAg)及HBcAg抗原肽刺激急性乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMCs)，建立HBcAg特异性T细胞系和CTL克隆，并对细胞系和细胞克隆进行了初步功能鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料 RPMI-1640培养基、胎牛血清(FBS)、青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺购自美国Invitrogen公司；人淋巴细胞分离液购自AXIS-SHIELD公司；重组人白细胞介素-2(rhIL-2)、重组人白介素-7(rhIL-7)购自R&D公司；植物血凝素(PHA)购自Sigma公司；重组乙型肝炎核心抗原(rHBcAg)购自Prospec公司；乳酸脱氢酶细胞毒检测试剂盒购自Promega公司；固相酶联免疫斑点技术(ELISPOT)试剂盒购自U-Cytech公司；鼠抗人CD3-FITC、CD8-PE、CD4-APC荧光抗体均购自BD公司；HBcAg抗原肽(Core 18-27:FLPSDFFPSI，Core 107-115:CLTFGRETV)由上海生工生物工程公司合成，纯度大于95%；流式细胞仪FACS Calibur购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 外周血PBMCs的制备 血标本来自1名26岁男性急性乙型肝炎患者，诊断符合中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会 2000 年联合修订的《病毒性肝炎防治方案》[5]。患者采血时血清指标：HBsAg(+)、HBsAb(-)、HBeAg(-)、HBeAb(+)、HBcAb(+)、HBcAb-IgM(+)、HBV DNA(<500 copies/mL)；血清抗 HAV-IgM、抗 HCV、抗 HEV及抗 HIV 检测均为阴性。经患者知情同意后，无菌采集静脉血10 mL，加等量RPMI-1640培养液稀释混匀，缓慢叠加至淋巴细胞分离液上，2 000 r/min 离心20 min，收集 PBMCs 层。以RPMI-1640培养液重复洗涤3次，调整 PBMCs 浓度至 2×106个/mL，混悬于含10% 胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养液中备用。

1.2.2 人类白细胞抗原A2阳性(HLA-A2)分型 取抗凝外周血50 μL加入1 μL 鼠抗人HLA-A2-PE抗体或同型对照抗体，混匀后室温避光孵育30 min，加入红细胞裂解液，混匀后室温避光孵育10 min，离心后PBS洗涤2次，细胞重悬于200 μL PBS中上FACS Callibur 流式细胞仪检测。

1.2.3 HBcAg特异性CD8+T细胞系的建立 向浓度为2×106个/mL 的PBMCs中加入终浓度1 μg/mL 的rHBcAg及终浓度2 mmol/L-谷氨酰胺，于24孔培养板中在37 ℃、5%CO2条件下培养。试验第4天离心细胞换液至新鲜含2 mmol/L谷氨酰胺、10%FBS的RPMI-1640培养液中，并加入rhIL-2至终浓度12 U/mL；第7、10天分别换液，培养至2周。

1.2.4 ELISPOT法鉴定HBcAg特异性T细胞系 严格按照UCytech公司IFN-γ 细胞因子ELISPOT试剂盒说明书进行操作，主要步骤如下：溶解包被抗体，预先包被于96孔聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上；每孔加入3×105个PBMCs细胞，同时加入HBsAg(10 ng/μL)，设立不加任何抗原的空白对照和加PHA的阳性对照，37 ℃、5%CO2培养箱中培养20 h，洗涤后加入生物素标记二抗，37 ℃孵育1 h，洗涤后加入辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记抗生物素抗体，37 ℃孵育1 h，洗涤后再加入AEC显色底物，室温孵育30 min后，可见紫色斑点，其中一个斑点代表一个能够产生IFN-γ的细胞。晾干PVDF膜后，经自动ELISPOT分析仪读取斑点数目。

1.2.5 HBcAg抗原肽特异性CTL克隆的筛选 将上述T细胞系加入混合后的2条抗原肽(终浓度10 μg/mL)及异体饲养细胞，培养2 d后换液至含IL-2(终浓度12 U/mL)、IL-7(终浓度5 ng/mL)、10%FBS的RPMI-1640培养液中，再培养5 d，如此7 d为一个循环；培养2个循环后，采用有限稀释法进行克隆。有限稀释时细胞培养液为含rhIL-2(50 U/mL)、rhIL-7(25 ng/mL)、PHA(1 μg/mL)、10%FBS和异体饲养细胞(2×105个/孔)的RPMI-1640培养液。根据细胞克隆生长情况加入刺激物、换液及扩大培养。

1.2.6 抗原特异性CTL克隆的纯度鉴定 细胞克隆长成后，取少量细胞经PBS洗涤1次，与鼠抗人CD3FITC/ CD8-PE/CD4-APC 荧光抗体室温避光孵育30 min，洗涤后重悬于200 μL PBS中，上流式细胞仪进行分析。

1.2.7 抗原肽特异性CTL克隆功能测定 采用EB病毒诱导的方法建立同一患者B淋巴母细胞系，建系方法参考文献[6]。B淋巴母细胞系在含HBcAg抗原肽(终浓度10 μg/mL)的细胞培养液中培养过夜，洗去游离抗原肽后，即为靶细胞。将CTL克隆与靶细胞按效靶比2∶1和5∶1混合(总体系200 μL)，种于96孔U底板，低速离心后在37 ℃、5%CO2条件下孵育 4 h，取上清液50 μL加LDH基质液50 μL，混匀后室温避光育30 min，加中止液后用酶标仪读取波长490 nm 吸光度值(OD490)。计算公式：细胞毒活性(%)=(试验孔OD490-CTL细胞自发释放孔OD490-靶细胞自发释放孔OD490)/(靶细胞最大释放孔OD490-靶细胞自发释放孔OD490)×100%。

2 结果

2.1 HBcAg特异性CD8+T细胞系的建立 通过ELISPOT法，抗原特异性T细胞在经过HBcAg刺激后会分泌IFN-γ，被特异性抗IFN-γ捕获后经染色可形成肉眼可见的斑点，见图1。建系前每3×105个PBMCs中含HBcAg抗原特异性T细胞9个，建系后每3×105个PBMCs中含HBcAg抗原特异性T细胞85个，建立细胞系的过程使HBcAg抗原特异性T细胞得到极大的扩增。

图1 建系前后HBcAg特异性T细胞的检测

2.2 HBcAg抗原肽特异性CTL克隆细胞纯度的测定 用2条抗原肽刺激T细胞系，再经过有限稀释，共获得15株CTL克隆。经荧光抗体染色后分析细胞纯度发现15个克隆细胞均为CD3+/CD8+/CD4-T细胞株，其中CD3分子的表达率大于90%，CD8分子的表达率大于85%，PBMCs和抗原特异性CTL纯度鉴定的代表图见图2。

2.3 HBcAg抗原肽特异性CTL克隆细胞毒活性测定 采用LDH释放试验测定HBcAg抗原肽特异性CTL细胞毒活性(表1)，结果显示：15 个克隆株中的14个具有较强细胞毒活性，包括抗原肽Core18-27特异性CTL克隆8株(1B3，1D9，1F2，2B3，2D2，3B10，3D6，3E4)，抗原肽Core107-115特异性CTL克隆4株(1B5，1C4，2E2，2F8)，对2条HBcAg抗原肽有交叉反应性克隆2株(2E5，3B5)，仅1株克隆(2C11)未表现出明显细胞毒活性。且当效靶比增加时，各CTL克隆的细胞毒活性亦相应增强。而未加特异性抗原肽的B细胞系作靶细胞检测不出细胞毒活性，说明本试验的特异性非常可靠。

图2 PBMCs和抗原特异性CTL中CD3+/CD8+细胞染色示例图

表1 HBcAg抗原肽特异性CTL克隆细胞毒活性测定(%)

3 讨论

急性肝炎患者体内可产生较强的、针对HBV多个抗原不同表位的多克隆特异性CTL细胞应答，而慢性HBV感染者的特异性CTL应答则较弱，机体对病毒呈免疫耐受或部分免疫耐受状态[7]。病毒特异性CTL对HBV感染的结局有至关重要的影响，文献用敲除实验证实敲除CD8+T细胞的小鼠无法最终清除病毒[8]。HBcAg特异性CTL是患者病毒特异性CTL的一个重要组成部分，由于HBcAg一般在血清中不会游离存在，避免大量游离抗原对HBcAg特异性CTL的消耗，而且HBcAg常被感染的肝细胞提呈，使得HBcAg特异性CTL成为机体清除HBV及HBV感染肝细胞的重要力量，具有极大的临床应用价值[9]。

通过HBcAg刺激急性乙肝患者PBMCs，再用IL-2扩增细胞构建抗原特异性T细胞系。在HBcAg刺激PBMCs过程中，PBMCs中的单核细胞、DC等抗原提呈细胞对HBcAg进行吞噬和加工，再通过MHC分子提呈给T细胞，提供T细胞第一活化信号；抗原提呈的时候，单核细胞或DC细胞会同时上调B7分子，与T细胞上CD28结合，提供T细胞第二活化信号。经过第一、第二信号活化的T细胞获得了增殖能力，在IL-2作用下，可呈对数生长。而其他的非HBcAg特异性T细胞则不会增殖，从而使得抗原特异性T细胞在建系过程中得到富集。在本试验中，建系前每3×105个PBMCs含9个抗原特异性T细胞，建系后这一数目扩增至85个，HBcAg特异性T细胞得到极大的富集。

利用建系过程对抗原特异性T细胞的扩增，再用ELISPOT法检测特异性抗原刺激下分泌IFN-γ的T细胞数目，是研究慢性乙肝患者抗原特异性T细胞数量和功能的有效方法之一。由于慢性乙肝患者特异性T细胞数量极少，用直接ELISPOT或HBV抗原肽五聚体方法常难以检测到，用建系的方法对抗原特异性T细胞进行扩增后再行检测，成为测量慢性乙肝患者细胞免疫功能更实用的技术手段。文献即用此方法发现在年轻的免疫耐受期慢性乙肝患者体内抗原特异性T细胞依然保持功能完整[10]。除此之外，抗原特异性T细胞系还可以用来制备抗原肽特异性CTL克隆。本研究根据文献[7]合成2条T细胞优势表位抗原肽，通过HBcAg抗原肽刺激T细胞系，再用IL-2/IL-7联合扩增抗原肽特异性CTL克隆。由于IL-7是扩增CD8+T细胞较特异性细胞因子，因此本研究未像其他研究加入抗CD4抗体杀灭CD4+T细胞，因为少量CD4+T细胞的存在对CD8+T细胞的增殖和分化具有辅助作用[11-12]。通过有限稀释方法筛选HBcAg抗原肽刺激后的T细胞系，本研究最终获得15株CTL克隆，用流式染色方法分析细胞克隆纯度发现所有CTL克隆均为CD3+CD8+T细胞克隆；用细胞毒试验验证CTL的特异性发现，14株CTL克隆表现出对荷肽靶细胞特异性杀伤能力，为后续实验奠定良好基础。

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洪宇(1975-)，讲师，硕士，主要从事病原生物学、免疫学分析方向研究。

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.02.037

R373.2

B

1671-8348(2015)02-0248-03

2014-08-05

2014-10-19)