自噬抑制剂3-MA对结直肠癌细胞Jagged-1蛋白表达及其增殖的影响



自噬抑制剂3-MA对结直肠癌细胞Jagged-1蛋白表达及其增殖的影响

谢杰斌1，庞月珊2，王崇树1，魏寿江1，王攀1，唐景1

(1.川北医学院附属医院胃肠外科，川北医学院肝胆胰研究所;2.川北医学院附属医院疼痛科，四川南充637000)

【摘要】目的:探索自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine 3-MA)对结直肠腺癌细胞Jagged-1蛋白表达及其增殖活性的影响。方法:实验分为对照组和3-MA药物组(5 mmol/L)，利用CCK-8法检测细胞活性;用Annexin/PI双染法检测细胞凋亡率;采用免疫组化和Western blot检测Jagged-1蛋白在两组中的表达差异。结果: Western blot及免疫组化结果表明: 3-MA作用后，与对照组比较，结直肠腺癌细胞内Jagged-1蛋白的表达显著被抑制(P＜0.05); 3-MA作用后，结直肠腺癌细胞增殖率为(85.23％±5.61％)，与对照组增值率比较具有显著差异(P＜0.05); 3-MA作用后，结直肠腺癌细胞凋亡率为(11％± 4.3％)，与对照组凋亡率(4.5％±2.1％)比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。结论: 3-MA可能通过抑制结直肠腺癌细胞中Jagged-1蛋白表达和结直肠腺癌细胞增殖、促进凋亡，从而发挥抗肿瘤生物学作用。

【关键词】Jagged-1;结直肠腺癌;自噬;3-甲基腺嘌呤

结直肠癌是临床中常见消化道恶性肿瘤，手术及化疗是其主要的治疗手段，尽管近年在手术、放疗、化疗及生物治疗等方面取得一定的进展，但由于肿瘤细胞的异质性及其对化疗药物的耐药性，使目前疗效受到不同程度的限制，大部分患者死于复发与转移，严重威胁人类的健康。研究发现自噬和Notch信号通路在肿瘤的发生发展中都具有重要的作用［1-3］，然而，关于两者之间有无相互影响目前尚不十分明确。本实验采用经典自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)抑制结直肠癌细胞的自噬活性，初步探讨抑制结直肠癌自噬活性后对Notch信号通路的主要配体—Jagged-1蛋白表达的影响，为进一步研究两者的关系提供实验基础。

1　材料与方法

1.1细胞及主要试剂

人大肠癌细胞株SW480购于中科院上海细胞库; CCK-8试剂盒购于中国南京凯基生物科技公司;胎牛血清(优级)购于杭州四季青生物工程材料有限公司;3-MA购于美国Gibco公司;兔抗人Jagged-1多克隆抗体购于美国Santa Cruz公司; WB相关试剂购于北京鼎国昌盛生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养及分组细胞在含15％胎牛血清的新鲜1640培养基中培养，培养条件37℃，二氧化碳体积分数为5％，饱和湿度，待细胞达到80％的生长面积时，按不同处理因素随机分为对照组与3-MA药物组。3-MA药物组加入3-MA (终浓度为5 μmol/L);对照组加入相同体积的培养基。

1.2.2细胞增殖活性的检测挑选处于对数生长期生长状态良好、存活率较高(90％以上)且致密度约为70％～80％的SW480细胞，吸出培养液，PBS洗1次，0.25％胰酶消化，制成单细胞悬液，每组6个复孔，按1×105个/孔接种细胞于96孔板上，培养24 h后，3-MA药物组加入含3-MA的培养基(终浓度为5 μmol/L)，对照组加入相同体积的培养基。37℃培养箱继续培养24 h，后每孔加入10 μL CCK-8试剂，37℃继续孵育培养3 h，酶标仪测450 nm光吸收值(OD值)。计算细胞增殖率。细胞增殖率(％)= (加药孔OD值-空白孔OD值)/(对照孔OD值-空白孔值OD值)×100％。

1.2.3细胞凋亡率检测取对数生长期的SW480细胞，经消化后制成单细胞悬液，每组6个复孔，按5×106个/孔接种细胞于96孔板上，细胞贴壁后，按实验分组用药物处理后继续培养24 h，PBS洗涤2次后，离心弃去上清后，加入500 μL染色缓冲液，然后加入5 μL Annexin-FITC试剂和10 μL PI，混匀，室温下避光孵育15 min，上流式细胞仪检测。

1.2.4免疫组化检测Jagged-1蛋白在各组中的表达6孔板中置入预先处理过的无菌盖玻片，将制备好的细胞悬液加入6孔板中，使得每个孔中细胞量约为1×105/2 mL培养基，放置于37℃、5％ CO2的培养箱中培养24 h后各组加入相应药物，继续培养24 h。取出6孔板，用PBS轻柔地流水冲洗3次;然后4％的PFA(多聚甲醛)2 mL室温固定15 min;去除PFA，细胞用PBS清洗1次;采用免疫组化SP二步法检测，步骤参照试剂盒说明书操作。用PBS做空白对照，已多次检测为阳性的标本做阳性对照，Jagged-1抗体稀释浓度为1∶100，抗体孵育为37℃1 h，用IPP 6.0行结果分析。

1.2.5Western blot检测Jagged-1蛋白在各组中的表达蛋白的提取:对照组和3-MA药物组用药处理后培养24 h，收集细胞，每瓶加入120 μL预先冷却的细胞裂解液(RIPA)，混匀，冰浴下摇动15 min进行裂解，预冷的离心机中以14 000 r/min速度离心15 min，取上清转移入新的离心管中-80℃保存待用。BCA法测蛋白浓度。用4×上样缓冲液将蛋白稀释成相同浓度，沸水中煮3 min，分装后-80℃保存备用。以40 μg总蛋白上样进行SDS-PAGE凝胶(分离胶10％，浓缩胶5％)在4℃条件下电泳，恒流(20 mA分离胶，然后60 mA恒定电流电泳至溴酚蓝刚出胶底部); 30 mA恒流条件下，4℃转移过夜。5％的BSA封闭1 h;加一抗(1∶500))，4℃过夜;37℃复温2 h，TBST洗膜(5 min×3次)，加辣根过氧化物酶标记二抗(稀释比为1∶4 000)，37℃孵育2 h; TBST洗膜(5 min×3次); ECL显像，凝胶成像仪照相，用Quantity One行结果分析。

1.3统计学分析

采用SPSS16.0软件和GraphPad Prism5软件进行统计分析和作图。每次随机试验独立重复6次，所有数据均用均数±标准差(±s)表示，用独立样本t检验比较组间差异，P＜0.05具有统计学意义。

2　结果

2.13-MA对结直肠癌细胞Jagged-1蛋白表达的影响

免疫组化表明Jagged-1蛋白在结直肠腺癌细胞SW480中高表达，但经3-MA处理后，Jagged-1的表达明显受到抑制，大多数细胞呈弱阳性表达，差异具有统计学意义(P＜0.05，t = 17.84)(图1)。Western blot结果与免疫组化结果一致，3-MA显著抑制了结直肠腺癌细胞SW480中Jagged-1蛋白的表达，差异具有统计学意义(P＜0.05，t =45.38)(图2)。

2.23-MA对细胞增殖的影响

3-MA对SW480细胞增殖活性具有抑制作用，其增殖率为(85.23％±5.61％)，与对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.05，t = 8.64)，表明3-MA有抑制肿瘤细胞增殖的作用(图3)。

2.33-MA对细胞凋亡的影响

与对照组相比，3-MA对SW480细胞凋亡具有促进作用，3-MA处理后的SW480细胞凋亡率为(11％±4.3％)，与对照组(4.5％±2.1％)比较差异具有统计学意义(P＜0.05，t = 6.43)，表明3-MA有促进抗肿瘤细胞凋亡的作用(图3)。

图1　3-MA对SW480细胞中Jagged-1蛋白表达的影响（免疫组化染色，×400）*P<0.05，与对照组比较。

图2　3-MA对SW480细胞中Jagged-1蛋白表达的影响（Western blot）*P<0.05，与对照组比较。

图3　3-MA对SW480细胞增殖率和凋亡率的影响

3　讨论

Notch是进化高度保守的信号传导系统，由受体和相应配体组成，Jagged-1是第一个被证实的Notch配体，能结合Notch1、Notch2和Notch4，当Jagged-1与相应配体结合后，在γ-分泌酶的介导下Notch的胞内段裂解，最终释放其活性片段NICD (Notch-1 intracellular domain)，经核定位序列介导转移至细胞核内，激活其下游靶基因如Hes1、hey、CyclinD1和c-Myc等的表达［4-6］，从而调节肿瘤细胞的增殖及凋亡，现已发现多种肿瘤组织中有Jagged-1的高表达［7-9］。在结直肠癌中的研究表明Jagged-1的高表达与其结直肠癌细胞的分化及转移有密切相关［9］;沉默Jagged-1基因在结直肠癌细胞中的表达，能抑制肿瘤细胞的分化和侵袭能力［10］。在前列腺癌中的研究表明的高表与其恶性程度、淋巴转移，细胞分化程度等成正相关［8］。我们在前期临对结直肠癌患者标本，检测了Jagged-1的表达情况［11］，也得到一致的研究结果。Notch信号通路的调控非常复杂，其中Jagged-1表达量的变化是其重要的调节机制，但机体通过何种机制调控Jagged-1量的变化，目前尚不清楚。

自噬作为一种高度保守的细胞行为，指细胞在缺乏营养和能量供应时，部分细胞质与细胞器被包裹进一种特异的双层膜或者多次膜结构的自噬体中，形成的自噬体在与溶酶体融合形成自噬溶酶体，胞质和细胞器成分在这里被降解为核苷酸，氨基酸、游离脂肪酸等小分子物质，这些小分子物质可以重新被利用合成大分子或者ATP［12］。Jagged-1是否也能够通过自噬活性来实现自身量的调节，目前尚不清楚。最近在果蝇体内发现一个参与自噬前体稳定的基因danc，其突变能抑制自噬的发生并表现为翅缘缺口(Notch基因的表型)，添加该基因时能取消上述效果［13］，表明自噬可能通过调节Notch信号活性通路发挥生物学作用，为此本研究采用经典自噬抑制剂3-MA抑制结直肠癌细胞的自噬活性，检测其对Jagged-1表达的影响，明确自噬抑制剂3-MA能否通过改变Jagged-1的表达量发挥其生物学功能。本研究结果显示结直肠癌腺癌细胞经3-MA作用后Jagged-1蛋白表达较对照显著下降，而非上升，表明自噬抑制剂3-MA降低Jagged-1蛋白的表达量，可能不是其通过对细胞自噬活性改变来实现的，可能是通过其他机制。最近有研究表明3-MA的抗癌活性与细胞的自噬活性无关，支持本研究结果［14］，但具体机制有待进一步研究;同时3-MA对结直肠腺癌细胞增殖活性的检测表明3-MA本身具抗肿瘤作用，推测其抗肿瘤作用可能主要是通过抑制肿瘤关键生存信号通路如Notch等提高肿瘤细胞对放化疗的敏感性，其具体机制有待进一步研究。

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(学术编辑:王崇树)

网络出版时间: 2015-3-5 12∶47网络出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20150305.1247.014.html

Effect of 3-methyladenine on expression of Jagged-1 and cell proliferation in colorectal cancer cell

XIE Jie-bin1，PANG Yue-shan2，WANG Chong-shu1，WEI Shou-jiang1，WANG Pan1，TANG Jing1

(1.Department of Gastrointestinal Surgery，Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College，Institute of Hepatobiliary and Pancreatic Intestinal Disease;2.Department of Pain Management，Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College，Nanchong 637000，Sichuan，China)

【Abstract】Objective: To investigate the effects of 3-methyladenine on the expression of Jagged-1 and cell proliferation in colorectal cancer cell.Methods: The expression of Jagged-1 protein was investigated by immunohistochemical staining and Western blot; the cell proliferation of colorectal cancer cell line SW480 measured by CCK8; apoptosis rate was detected by double Annexin/PI staining.Results: Compared with the control group，the expression of Jagged-1 protein was obviously inhibited as a result of immunohistochemical staining and wester blot(P＜0.05); After treated by 3-Methyladenine，the cell proliferation rate of colorectal cancer cell was (85.23±5.61)％ which was obviously lower than the control group; The 3-MA treated group apoptosis rate was(11±4.3)％ which was obviously higher than the control group(4.5±2.1)％(P＜0.05).Conclusion: The antitumor effect of 3-MA may inhibite proliferation and promote apoptosis on colorectal cancer cell through inhibiting the expression of jagged-1 protein.

【Key words】Jagged-1; Colorectal cancer; Autophagy;3-methyladenine

作者简介:谢杰斌(1984-)，男，四川南充人，硕士，助教，主要从事消化道肿瘤的基础与临床，糖尿病外科治疗。E-mail: xiejiebin84@126.com

基金项目:四川省教育厅基金项目(13ZB0243);川北医学院科研发展计划项目(CBY12-A-QN20)

收稿日期:2014-06-26

doi:10.3969/j.issn.1005-3697.2015.01.14

【文章编号】1005-3697(2015)01-0060-04

【中图分类号】R735.3

【文献标志码】A