介入栓塞法小型猪急性心肌梗死模型的建立



介入栓塞法小型猪急性心肌梗死模型的建立

刘兴华1，董国礼2，张小明2，缪南东2，任勇军2，张军辉3，曹礼庭3

(1.重庆三峡中心医院放射科，重庆万州404000;2.川北医学院附属医院放射科，四川南充637000; 3.川北医学院附属医院超声科，四川南充637000)

【摘要】目的:用介入栓塞法建立小型猪的急性心肌梗死模型。方法: 11头贵州种小型猪，体重30～45 kg。术前采集血液进行实验室检查(心肌酶谱和肌钙蛋白等);并行心电图及超声心动图检查。常规冠状动脉造影后，经导管将栓子推送到左冠状动脉前降支或回旋支远端进行栓塞，复查造影结果满意后结束手术操作，并复查心电图。术后24 h采集血液复查实验室指标，并复查超声心动图。术后5周处死实验动物行心脏病理组织学检查。手术前后的实验室检查指标及心功能指标(射血分数和短轴缩短率)采用配对t检验。结果: 11头小型猪中，有8头成功建立急性心肌梗死模型，建模成功率72％。栓塞前:各项检查结果正常。栓塞后:冠状动脉造影检查栓塞远端未见显影;心电图出现不同程度的异常改变;实验室检查及心功能检查与术前比较，其差异具有统计学意义(P＜0.05);术后病理证实均有梗塞灶的存在。结论:介入栓塞法成功率高，简单易行，是建立稳定心肌梗死模型的较好方式之一。

【关键词】心肌梗死;栓塞;小型猪

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是心肌的缺血性坏死，为在冠状动脉病变的基础上，发生冠状动脉血供急剧减少或中断，使相应的心肌严重而持久的急性缺血所致［1］。由心肌梗死引起的心肌功能失代偿是成人心血管疾病中发病率和死亡率最高的病因之一［2］，冠心病在欧美发达国家常见，在我国发病率虽不如欧美国家，但近年来随着人口老龄化，其发病亦呈逐年上升趋势。有关心肌梗死的研究备受关注。心肌梗死的动物模型对临床研究心肌梗死的病理生理及治疗具有重要意义。小型猪的心脏解剖结构、血管分布和心脏/体质量比与人的心脏相似，两者冠脉侧支分布均较少，故成为建立心肌梗死模型的良好选择。目前心肌梗死的造模方法多采用开胸结扎法和介入栓塞法。本研究拟用介入栓塞法建立小型猪的急性心肌梗死模型，并通过手术前后冠状动脉造影、实验室检查、心电图、超声心动图及术后病理等检查验证造模是否成功，为下一步干细胞治疗的研究提供可靠的动物模型。

1　材料与方法

1.1主要实验材料

1.1.1实验动物11头贵州种小型猪，体重30～45 kg，雌雄不拘，由成都达硕生物科技有限公司提供。

1.1.2实验设备GE数字减影血管造影机(型号: Advantx-Lcv-Plus); Philips Sonos 7500超声多普勒诊断仪。

1.1.3实验药品氯胺酮(2 mL∶0.1 g，江苏恒瑞医药股份有限公司)、安定(2 mL∶10 mg，天津药业焦作有限公司)、碘海醇(100 mL∶300 mgI/mL，扬子江药业有限公司)。

1.2实验方法

1.2.1建模方法术前禁食12 h，禁水6 h。用氯胺酮12 mg/kg，安定0.2 mg/kg耳后肌内注射使动物麻醉。动物安静后，将猪呈仰卧位固定于检查床上，用22G留置针建立耳缘静脉通道，配制氯胺酮500 mg、安定20 mg与500 mL生理盐水混合液，经耳缘静脉滴注维持麻醉，视麻醉深度调节静滴速度。于心前区及双侧腹股沟区备皮，心前区贴电极片后接心电监护仪，腹股沟区以碘伏消毒后铺无菌单。用桡动脉穿刺针穿刺右侧股动脉，置入5F动脉鞘，在导丝引导下，插入左冠导管超选行左冠状动脉造影证实后插入3F微导管，于左冠状动脉回旋支或前降支远端造影并证实，透视下缓慢推入3根1 cm长的4＇丝线线段。栓塞后心电图示有心肌缺血或梗死改变(T波倒置、ST段抬高，R波波幅降低等)。回退微导管于左冠状动脉口进行造影，证实回旋支或前降支远端闭塞，拔出微导管及左冠状导管，加压包扎30 min，观察穿刺点无血肿及出血后，放入笼中单独喂养。术前2 d及术后1周用抗生素预防感染。

1.2.2冠状动脉造影观察小猪栓塞前冠状动脉主干及分支是否通畅，管腔有无异常扩张或狭窄，心脏搏动有无异常;栓塞后观察栓塞部位远端血管显影情况，远端血管有无再通，心脏有无异常搏动。

1.2.3心电图检查观察术前及术后心电监护仪显示的心电图QRS波波形变化、峰值大小、时间长短、心率等。

1.2.4实验室检查术前及术后24 h，分别抽血行心肌酶谱(门冬氨酸氨基转移酶AST;乳酸脱氢酶LDH;肌酸激酶CK;羟丁酸脱氢酶HBDH;肌酸激酶-MB活性CK-MB)和心肌肌钙蛋白-l(Tnl-ADV)检查。抽血前进行肌注麻醉，剂量同前。

1.2.5超声心动图检查建模前后，采用常规超声技术观察室壁回声，左室前间隔、下侧壁基底段及中间段收缩期厚度、舒张期厚度、运动幅度及左室射血分数(ejection fraction，EF)、短轴缩短率(fractional shortening，FS)。

1.2.6病理组织学检查术后5周处死动物，取出心脏。以1头正常小猪的心脏作病理对照。术后第2天死亡的小猪心脏亦取出做病理检查。肉眼观察:心脏解剖形态、梗死灶大体位置、范围、颜色等，心腔有无扩大，室壁有无变薄，有无附壁血栓，观察栓子位置。用1∶10甲醛液固定48 h，于左室梗死区、梗死边缘及正常组织区域分别取材，HE染色后制成石蜡切片。镜下观察:心肌细胞及细胞核的大小、形态、色泽，梗死周围有无炎细胞浸润、有无纤维组织和/或瘢痕形成。

1.3统计学分析

未穿刺成功的、术中及术后第2天死亡的小猪不纳入统计计算。栓塞前及栓塞后24 h血液的心肌酶谱和肌钙蛋白运用配对t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。建模前后的心功能(取射血分数，短轴缩短率)比较采用配对t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。统计软件运用SPSS13.0。

2　结果

2.1建模结果与冠状动脉造影

11头行介入栓塞的小猪，其中1头因股动脉痉挛未穿刺成功，1头在手术过程中因肝素化程度不够导致大面积心肌梗死，发生室颤而死亡，1头于术后第2天死亡。其余8头存活到术后第5周。存活到术后第5周的8头小猪术前冠脉造影:左冠状动脉主干及各级分支血管通畅，未见异常狭窄及扩张(图1A);术后:所有小猪冠脉栓塞部位远端血管未见显影，无再通，提示栓塞成功(图1B)。

2.2术前及术后心电图表现

存活到术后第5周的8头小猪在栓塞前心电图未见异常(图2A)，栓塞后5～10 min，在Ⅴ1导联出现不同程度的ST段抬高、R波波幅降低，3例在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅴ1导联上出现室性早搏(图2B)。

2.3实验室检查结果

存活到术后第5周的8头小猪术前及术后24 h心肌酶谱及肌钙蛋白结果对照见表1，术后24 h的各项实验室检查指标与术前比较，其差异均具有统计学意义。

图1　冠状动脉造影表现

图2　心电图表现

表1　小猪术前与术后24 h实验室检查结果对比

2.4超声心动图检查结果

存活到术后5周的8头小猪于术前、术后均行超声心动图检查。建模前，左室壁各节段厚度较均匀，未见局限性异常变薄或增厚，收缩期、舒张期波幅较一致，各节段回声均匀(图3A);建模后，所有病例(8/8)梗死节段变薄，波幅减弱，梗死节段回声局限性减弱(图3B)。射血分数(EF)及短轴缩短率(FS)梗死后较梗死前均减小，梗死前后射血分数及短轴缩短率比较见表2。术后24 h EF及FS与术前比较，P＜0.05为差异具有统计学意义。

图3　超声心动图表现

表2　建模前与建模后24 h心功能比较

2.5病理结果

2.5.1小猪正常心脏观察心脏大小、形态未见异常，色泽鲜红，心脏表面无瘢痕，冠状动脉走行清楚。镜下:心肌组织结构清楚，细胞形态、大小未见异常，胞核无固缩及溶解，间质内无炎性细胞浸润，冠脉内未见血栓及栓子(图4A)。

2.5.2术后第2天死亡小猪心脏观察心脏大体形态未见异常。镜下:梗死区心肌细胞胞核溶解、消失，胞浆均质红染，间质水肿，血管扩张充血，大量炎性细胞浸润(图4B)。

2.5.3心肌梗死模型心脏大体观察栓塞左前降支远端的心脏于左室前壁、前间隔或心尖部，栓塞回旋支的心脏于左室侧壁、后壁或下壁见苍白色梗死灶，因纤维组织增生瘢痕形成，局部凹陷，边缘不整齐。垂直于心尖与心底连线作连续横切断面，在梗死灶近端冠脉内见蓝色线头(图5)。镜下:所有梗死区大量纤维组织增生，瘢痕形成，在线头周围均见肉芽肿性炎症(图4C)。

通过上述手术前后冠状动脉造影、心电图检查、实验室检查、超声心动图检查及术后病理检查证实，存活到术后第5周的8头小猪均成功建立起心肌梗死模型，建模成功率约72％。

图4　小猪心脏病理图

图5　在梗死灶近端冠脉内见蓝色线头

3　讨论

3.1动物模型的选择

建立心肌梗死常用的动物模型有:鼠［3］、兔［4］、犬［5］、小型猪［6-13］等。鼠和兔的价格便宜、体型小而方便操作，容易控制较一致的品系，适用于发病机理和治疗方面的研究，但其体型太小而不宜对其进行监控和检查，如做MRI检查要专用的小动物线圈，无疑增大了实验成本，并且心脏/体质量比与人心脏有较大差异。犬的心脏侧支循环丰富，不易形成稳定的梗死灶，不利于对梗死范围及药物疗效做出评价。小型猪心脏的解剖结构、血管分布和心脏/体质量比与人的心脏相近，两者冠脉侧支分布均较少，容易形成较稳定的心肌梗死模型。因此，本研究用小型猪作为建立心肌梗死的模型。

3.2建模方法

建立心肌梗死动物模型的方法有:开胸结扎法［8，13］、介入栓塞法［6，7，9-11］、冷冻法［14］、药物法及Ameriod法等。目前较常用的为开胸结扎法和介入法，开胸结扎法定位虽然准确，但需要开胸，创伤较大、术后饲养困难、易感染和死亡。介入栓塞法的优点有: (1)临床废弃的导管、导丝和球囊可用于动物实验，降低了实验成本; (2)能够较精确的定位目标血管; (3)梗死机制与临床病理机制相似; (4)手术创伤小，不需开胸，有利于内环境稳定，对实验结果干扰因素小; (5)术后动物饲养简单，容易成活。缺点是:建模要在数字减影血管机上进行，操作者在操作过程中不可避免受到辐射，这就要求操作者操作要尽可能熟练，尽量减少辐射剂量。本研究采用介入栓塞法建立心梗模型，11头小型猪，1头穿刺失败，1头术中死亡，1头于术后第2天死亡，建模成功率为72％。

3.3如何提高建模成功率

结合本研究，笔者总结用介入栓塞法建立小型猪急性心肌梗死模型应注意以下问题，以提高建模成功率: (1)小型猪的体重要控制在适当的范围，以30～40 kg为宜。体重过轻，因股动脉太细增加了穿刺难度，穿刺时间较长，无疑增加了操作者辐射剂量;体重过重，动物的搬运和检查比较困难。(2)动物的麻醉是手术成败的关键，所以在手术过程中应注意麻醉深度。在穿刺成功前，麻醉不宜过深，过深会导致血压下降，血管收缩，这时可以肌注阿托品升高血压，心率以在100次/min左右为宜。穿刺成功后，可以适当加深麻醉，以避免动物在操作过程中躁动而增加创伤。(3)一般情况下，经皮股动脉穿刺即能穿刺成功，但个别动物因皮下脂肪层太厚，寻找股动脉比较困难，可以通过切开皮肤及皮下组织，钝性分离出股动脉，提高造模的成功率。(4)在介入的过程中，要注意使血液肝素化，以免因血液的凝固性过高导致大量血栓形成，引发大面积心肌梗死。本研究在建模过程中一例因急性大面积心肌梗死引起室颤，最终动物死亡。(5)栓塞的部位以左前降支或回旋支远端1/3为宜，栓塞位置过高可导致栓塞面积过大而引起生命危险。(6)在整个手术过程中，要密切注意动物生命体征变化，备齐急救药品以对手术过程中出现的危急情况做出及时处理。(7)介入手术结束，拔出动脉鞘后要压迫止血，压迫时间以30 min为宜，压迫时间过短可能造成穿刺点继续出血、血肿形成。(8)手术前后要合理应用抗生素预防感染。

总之，用介入栓塞法建立小型猪急性心肌梗死模型，动物创伤较小，术后护理及饲养简单，建模成功率较高，能为后期的干细胞治疗提供稳定的动物模型，故逐渐被更多的实验者采用。

参考文献

［1］叶任高，陆再英.内科学［M］.第6版，北京:人民卫生出版社，2006:272.

［2］Minguell JJ，Erices A.Mesenchymal stem cells and the treatment of cardiac disease［J］.Exp Biol(Maywood)，2006，231(1): 39-49.

［3］肖骏，佘强，罗开良，等.大鼠慢性心肌梗死模型制备的改进［J］.四川动物，2008，27(3):396-398.

［4］沈伟，施海明，罗心平，等.兔实验性动脉粥样硬化和急性心肌梗死双模型的建立［J］.中国实验动物学报，2010，18(4): 318-321.

［5］金红峰，沈法荣，凌锋，等.应用聚乙烯泡沫封堵法建立Beagle犬心肌梗死模型［J］.中国病理生理杂志，2009，25 (8): 1660-1661，1664.

［6］卢新政，王连生，黄峻，等.冠状动脉堵闭法建立猪心肌梗死模型［J］.中国动脉硬化杂志，2004，12(2):218-220.

［7］孙帅，郭涛.冠状动脉堵闭法与栓塞法制备小型猪心肌梗死模型的对比［J］.中国组织工程研究与临床康复，2009，13 (50):9913-9916.

［8］谢忠忱，尹明，苟鹏，等.开胸与微创方法制备小型猪急性心肌梗死模型的对比研究［J］.中国比较医学杂志，2008，18(7): 46-49.

［9］李虎，贾国良，王海昌，等.介入技术建立心肌梗死猪动物模型［J］.心脏杂志，2005，17(4):334-336.

［10］陈欣，张小明，缪南东，等.介入栓塞法建立小猪心肌梗塞模型［J］.泸州医学院学报，2010，33(4):356-360.

［11］王静，周玉杰，葛海龙，等.冠状动脉结扎与微创方法制备小型猪急性心肌梗死模型的对比研究［J］.辽宁医学院学报，2010，31(5):397-399.

［12］李东，于铁链，李曦铭，等.中国实验用小型猪急性心肌梗死再灌注模型的建立［J］.天津医科大学学报，2010，16(3): 377-390.

［13］孙林，熊国昌，光雪峰，等.开胸结扎猪冠状动脉建立急性心肌梗死动物模型的研究［J］.昆明医学院学报，2006，27(3): 1-3.

［14］赵文萍，刘刚，郑晔，等.无呼吸机支持反复冷冻法建立大鼠急性心肌梗死模型［J］.第三军医大学学报，2007，29(4): 314-317.

(学术编辑:杨林)

网络出版时间: 2015-3-5 12∶47网络出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20150305.1247.012.html

Establishment of acute myocardial infarction model by interventional embolization in mini-pigs

LIU Xing-hua1，2，DONG Guo-li2，ZHANG Xiao-ming2，MIAO Nan-dong2，REN Yong-jun2，ZHANG Jun-hui3，CAO Li-ting3

(1.Department of Radiology，Chongqing Sanxia Central Hospital，Wanzhou 404000，Chongqing; 2.Department of Radiology，Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College，Nanchong 637000，Sichuan;3.Department of Ultrasonography，Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College，Nanchong 637000，Sichuan，China)

【Abstract】Objective: To establish acute myocardial infarction models by interventional embolization in mini-pigs.Methods: E-leven mini-pigs，weighting 30-45kg，were anaesthetized.Echocardiography and electrocardiogram examination as well as coronary artery digital subtraction angiography (DSA)were performed，and myocardial enzymes and troponin were tested before embolization.The distal of left descending artery or left circumflex artery was embolized with sterilized thread segment.In the 11 pigs，embolization was followed by the DSA procedure and electrocardiogram examination.Myocardial enzymes and troponin were tested and echocardiography was performed 24 hours after embolization，and pathologic histology was examined 5 weeks after embolization.Paired t-tests were used in the index of laboratory test and heart function before and after the operation.Results: The model of myocardial infarction was successfully established in 8 of 11 mini-pigs.The successful rate was 72％.All of the results were normal before embolization.After embolization，the coronary artery DSA showed that the object vessels were obstructed.The electrocardiogram examination showed abnormal changes in different degrees.The value of myocardial enzymes，troponin，ejection fraction and fractional shortening were significantly different between preoperative and postoperative examination (P＜0.05).The infarction sites were confirmed by pathologic histology after the operation.Conclusion: The technique of interventional embolization is simple and accessible，and has high successful rate.It is one of the bestbook=52,ebook=57methods to establish stable myocardial infarction models.

【Key words】Myocardial infarction; Embolization; Mini-pigs

通讯作者:董国礼，E-mail: guoli_d@163.com

作者简介:刘兴华(1979-)，男，重庆万州人，硕士，主治医师，主要从事医学影像诊断工作。

基金项目:四川省科技厅项目(05JY029-014-1)

收稿日期:2014-05-05

doi:10.3969/j.issn.1005-3697.2015.01.12

【文章编号】1005-3697(2015)01-0051-05

【中图分类号】R-332

【文献标志码】A