脓毒症大鼠急性肺损伤机制研究

黄立搜 楼黎明 王世强 胡丹丹 陈素珍 徐一凯 章 潜

脓毒症大鼠急性肺损伤机制研究

黄立搜 楼黎明 王世强 胡丹丹 陈素珍 徐一凯 章 潜

目的 探讨脓毒症大鼠急性肺损伤的机制。方法 采用盲肠结扎穿孔术（CLP）建立大鼠脓毒症模型。健康成年雄性SD大鼠48只，随机分为假手术组、脓毒症组，每组24只。动物模型制备成功后，于术后3、12、24h检测肺组织匀浆标本黄嘌呤氧化酶（XO）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）含量。光学显微镜下观察肺组织病理改变。结果 术后3、12、24h假手术组XO分别为（2.4±0.3）U/g、（2.3±0.5）U/g、（2.4±0.4）U/g，MDA为（15.7±2.7）nmol/ mg、（15.2±2.9）nmol/mg、（15.6±2.6）nmol/mg，SOD为（58.8±8.0）U/mg、（58.1±10.1）U/mg、（58.7±9.5）U/ mg，GSH-Px为（33.2±5.4）U/mg、（32.5±7.0）U/mg、（33.1±6.3）U/mg；脓毒症组XO分别为（4.2±0.6）U/ g、（5.5±0.7）U/g、（5.7±0.5）U/g，MDA为（29.3±5.7）nmol/mg、（36.3±6.6）nmol/mg、（41.4±7.3）nmol/mg，SOD为（43.3±7.0）U/mg、（41.8±6.9）U/mg、（38.2±7.4）U/mg，GSH-Px为（27.9±4.0）U/mg、（26.4±3.9）U/ mg、（24.3±3.3）U/mg。与假手术组比较，脓毒症大鼠肺组织XO、MDA含量显著升高，SOD、GSH-Px含量显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论 脓毒症大鼠存在急性肺损伤，其机制可能与氧化应激相关。

大鼠；脓毒症；肺损伤；黄嘌呤氧化酶；丙二醛；超氧化物歧化酶；谷胱甘肽过氧化物酶

1 实验材料

1.1 动 物 健康成年雄性SD大鼠48只，体质量280～350g，由浙江中医药大学动物实验中心提供，实验动物合格证号：SCXK（沪）2013-0016。

1.2 试 剂 黄嘌呤氧化酶（XO）试剂盒（美国RND公司，批号R3201L）；丙二醛（MDA）试剂盒（美国RND公司，批号R4785L）；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（美国RND公司，批号R4421L）；谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒（美国RND公司，批号R7098L）。

2 实验方法

2.1 分组及模型制备 健康成年雄性SD大鼠48只，随机分为假手术组、脓毒症组，每组24只。采用胡丹丹等[3]建立的盲肠结扎穿孔术（CLP）法制备大鼠脓毒症模型：大鼠经2%戊巴比妥钠（50mg/kg）麻醉后，沿腹正中作一长1.5cm的切口，打开腹腔后小心分离盲肠，避免碰触肠系膜血管，在盲肠根部结扎，在与肠系膜相对的盲端肠壁浆膜面用9号针头穿刺2次，轻挤出少量内容物，还纳盲肠于腹腔，关闭腹腔，逐层缝合，术后即刻予以皮下注射生理盐水10mL/kg补充手术过程中丢失的体液。假手术组除不结扎和穿刺盲肠外，其余操作同脓毒症组。

2.2 标本采集与指标检测 术后3、12、24h各组分别取8只大鼠，给予10%水合氯醛（0.3mL/100g）腹腔注射麻醉，经腹主动脉采血，处死。留取左肺固定于4%甲醛中石蜡包埋切片行HE染色，留取右肺置于-70℃冰箱，制作肺组织匀浆。酶联免疫吸附（ELISA）法检测肺组织匀浆标本黄嘌呤氧化酶（XO）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的含量。

2.3 肺组织病理观察 肺组织用梯度酒精脱水、浸蜡和包埋，制成石蜡块，用苏木素染色，盐酸酒精分化及自来水返蓝，之后伊红染色，再次脱水、透明、封片，于显微镜下观察炎症细胞浸润，光学显微镜下观察肺组织病理改变。

2.4 统计学方法 所有数据应用SPSS11.5统计软件处理数据，计量资料用均数±标准差（±s） 表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 大鼠肺组织病理结果 假手术组肺组织结构完整，肺泡腔清晰，水肿和炎症渗出少；随着时间的推移，与假手术组比较，模型组肺组织可见炎性细胞浸润逐渐加重，肺水肿、出血以及肺不张逐渐加重，肺泡间隔逐渐增厚并破坏，见图1（封二）。

3.2 大鼠肺组织XO、MDA、SOD、GSH-Px含量比较

与假手术组比较，脓毒症大鼠肺组织XO、MDA含量显著升高，SOD、GSH-Px含量显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01），见表1。

表1 两组大鼠肺组织XO、MDA、SOD、GSH-Px含量比较（±s）

表1 两组大鼠肺组织XO、MDA、SOD、GSH-Px含量比较（±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.01；XO：黄嘌呤氧化酶；MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶；GSH-Px：谷胱甘肽过氧化物酶

假手术组脓毒症组3h 12h 24h 3h 12h 24h 888888 2.4±0.3 2.3±0.5 2.4±0.4 4.2±0.6* 5.5±0.7* 5.7±0.5* 15.7±2.7 15.2±2.9 15.6±2.6 29.3±5.7* 36.3±6.6* 41.4±7.3* 58.8±8.0 58.1±10.1 58.7±9.5 43.3±7.0* 41.8±6.9* 38.2±7.4* 33.2±5.4 32.5±7.0 33.1±6.3 27.9±4.0* 26.4±3.9* 24.3±3.3*

4 讨论

脓毒症是临床较为常见的一种危重症，它除可引起剧烈的全身炎症反应外,还常导致肺、肝、肾、肠道、脑等多个器官的功能失常。尤其是脓毒症导致的肺损伤发生早、病情重，常是患者死亡的直接原因[4]。肺脏是脓毒症时最易受累的靶器官，表现为急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征。过度的炎性因子释放与氧化应激，共同促进急性肺损伤发生发展，目前其机制尚未完全明了，缺乏针对性的治疗措施。因而研究脓毒症导致肺损伤机制具有重要的意义[5]。

氧化应激在脓毒症的发生、发展中起重要作用，氧化应激产生大量自由基，可以和各种细胞成分发生不可逆反应，破坏细胞的结构和功能。氧化应激不但氧化蛋白质，改变蛋白质活性，导致蛋白酶释放，使抗氧化剂和抗蛋白酶失活，而且可以直接损伤DNA导致断裂和点突变；导致脂质过氧化，产生血管活性物质和前炎性物质如血栓素；改变转录因子，导致前炎性物质基因表达增强[6]。最终导致肺微血管完整性和肺泡屏障破坏，并且损伤Ⅱ型肺泡上皮细胞，引起板层状小体水肿、崩解，肺表面活性物质减少、功能下降，从而导致急性肺损伤的发生[6]。黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）是嘌呤核苷酸的分解代谢酶，对自由基的产生有重要作用，反映缺氧损伤的情况[7]。急性肺损伤时，组织缺血/缺氧，组织中的黄嘌呤脱氢酶可变构为XO。机体内XO活性增高，意味着机体内黄嘌呤氧化酶系统的激活,氧自由基的生成增多。丙二醛（malondialdehyde，MDA）是自由基与细胞的膜性结构，如细胞膜、线粒体膜等发生脂质过氧化反应的产物，它反映体内氧自由基生成量及活性，间接地反映细胞受损的程度[8]。即机体内氧自由基的活性越高，脂质过氧化反应越强，则组织细胞的损伤越重。MDA含量的变化可代表体内氧自由基的变化，进而反应肺内氧化损伤程度。MDA含量增加表明CLP术后氧自由基产生增多，导致细胞膜脂质过氧化，损伤肺泡细胞[9]。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是重要的抗氧化酶，其参与清除超氧阴离子、减少还原型亚硝酸盐的形成及所致的损伤，对肺具有保护作用[10]。胞外SOD的表达活性水平与肺损伤的程度呈明显负相关[11-12]，而氧化应激产物可降低该酶活性[13]。本研究结果显示，在CLP术后24h，脓毒症组大鼠血清SOD活性水平显著下降，即脓毒症时机体存在抗氧化能力减弱的情况。谷胱甘肽过氧物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）是氧自由基清除酶，是肺组织重要的抗氧化防御因子，它能够清除呼吸代谢过程中产生的大量过氧化物和羟自由基，从而减轻细胞膜多不饱和脂肪酸的脂质过氧化反应，清除脂类自由基,保护机体免受摄入脂质过氧化物的损害[14]，从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。CLP是比较公认的临床相关性较强脓毒症大鼠模型常用的方法，本研究显示，CLP能使大鼠体内自由基产生过氧化反应增加，导致脓毒症大鼠急性肺损伤，其具体机理有待进一步研究。

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（收稿：2015-06-15 修回：2015-07-28）

Mechanism of Acute Pulmonary Injury in Rats with Sepsis

HUANG Lisou,LOU Liming,WANG Shiqiang, HU Dandan,CHEN Suzhen,XU Yikai,ZHANG Qian Department of Respiratory Diseases,the Third Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310005),China

Objective To investigate the mechanism of acute pulmonary injury in sepsis rats.Methods Colon ligation perforation was applied to rats to establish sepsis model.Forty-eight healthy adult male SD rats were randomly divided into sham group and sepsis group（n=24 in each group）.At 3,12,24h after surgery,every 8 rats in each group were sacrificed to obtain lung tissue for determination of xanthine oxidase（XO）,malonaldehyde（MDA）, superoxide dismutase（SOD）,and glutathione peroxidase（GSH-Px）.Pathological changes of lung tissue was observed with light microscopy.Results At 3,12,24h after surgery in sham group,XO were 2.4±0.3U/g,2.3±0.5U/g,and 2.4±0.4U/g,MDA were 15.7±2.7nmol/mg,15.2±2.9nmol/mg,15.6±2.6nmol/mg,SOD were 58.8±8.0U/mg,58.1±10.1U/ mg,58.7±9.5U/mg,and GSH-Px were 33.2±5.4U/mg,32.5±7.0U/mg,33.1±6.3U/mg;in sepsis group,XO were 4.2± 0.6U/g,5.5±0.7U/g,and 5.7±0.5U/g,MDA were 29.3±5.7nmol/mg,36.3±6.6nmol/mg,41.4±7.3nmol/mg,SOD were 43.3±7.0U/mg,41.8±6.9U/mg,38.2±7.4U/mg,and GSH-Px were 27.9±4.0U/mg,26.4±3.9U/mg,24.3±3.3U/mg.Compared with sham group,the concentration of XO and MDA were significantly increased and SOD and GSH-Px were significantly decreased in sepsis group（P＜0.01）.Conclusion Sepsis rats suffer from acute pulmonary injury,which may be related to oxidative stress.

rats;sepsis;pulmonary injury;xanthine oxidase;malonaldehyde;superoxide dismutase;glutathione peroxidase脓毒症是细菌感染后引起的全身炎症反应，是危重患者手术后常见并发症，同时也是临床危重病患者死亡的重要原因之一。在众多脓毒症并发的器官损伤中，脓毒症导致的急性肺损伤（acute lung injury/acute respiratory distress syndrome，ALI/ARDS）发生早、病情重，也是加速患者死亡的重要原因[1]。盲肠结扎穿孔术（CLP）是目前公认的与临床相关性较强的脓毒症模型[2]，本研究采用CLP制备大鼠脓毒症模型，观察脓毒症大鼠肺损伤的机制，现报道如下。

浙江省中医药科技计划项目（No.2010ZA047）；浙江中医药大学附属第三医院院级医药卫生科技计划项目（No. ZS10ZA04）

浙江中医药大学附属第三医院呼吸科（杭州310005）

楼黎明，Tel：13505712348；E-mail：llm2348@hotmail.com