生长激素受体在宫腔粘连患者子宫内膜组织中的表达及意义

任 娟，卫 兵，宋恩学，王文艳，张丽丽

生长激素受体在宫腔粘连患者子宫内膜组织中的表达及意义

任 娟，卫 兵，宋恩学，王文艳，张丽丽

目的探讨生长激素受体（GHR）在宫腔粘连（IUA）患者子宫内膜组织中的表达及意义。方法通过免疫组化MaxVision两步法和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法分别检测IUA患者（研究组）和非IUA患者（对照组）子宫内膜组织中GHR蛋白和GHR mRNA的表达情况。结果研究组GHR蛋白表达、GHR mRNA和对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。子宫内膜腺体与子宫内膜间质中GHR蛋白表达比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论IUA患者子宫内膜组织中GHR的表达低于非IUA患者，而且这种表达在子宫内膜腺体中较多，在子宫内膜间质中较少，为IUA患者在宫腔粘连分离术术后使用生长激素提供一定的理论参考。

宫腔粘连；生长激素；生长激素受体

宫腔粘连（intrauterine adhesions，IUA）临床主要表现为月经量减少甚至闭经、周期性下腹痛、不孕、反复流产、产后胎盘粘连甚至植入等［1］。近年来IUA患病率逐年增加，IUA已严重影响着现代女性的生活质量和生育要求。IUA的治疗主要包括经宫腔镜下宫腔粘连分离术［2］（transcervical resection of adhesions，TCRA）和术后应用雌孕激素促子宫内膜生长。研究［3－4］报道，生长激素（growth hormone，GH）在体外受精－胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）中对反应不良性子宫内膜和子宫内膜反应不良性闭经中都有促进子宫内膜发育的作用，这些研究均提示GH可能促进子宫内膜的生长。部分研究者在此基础上试图加用GH来提高IUA治疗的效果［5］，但目前关于GH研究主要偏于临床，尚缺乏基础研究的证据。该研究通过免疫组化MaxVision两步法和实时荧光定量PCR（quantitative real time-PCR，qRT-PCR）法，研究生长激素受体（growth hormone receptor，GHR）在IUA和非IUA患者子宫内膜组织中的表达情况，为IUA患者TGRA术后使用GH提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例资料 选取2013年11月～2014年5月在安徽医科大学第二附属医院行宫腔镜检查并确诊为IUA患者28例作为研究组，年龄20～35 （29.62±2.52）岁。同期因其他原因（子宫纵隔、不孕或节育器嵌顿）行宫腔镜检查确诊为非IUA患者22例作为对照组，年龄20～40（28.80±3.34）岁，并且这些非IUA患者既往都有过宫腔操作史。

1.1.2 主要手术设备 宫腔镜及冷光源、腹腔镜、异物钳（德国STORZ公司）；监视器（日本SONY公司）；液体膨宫泵（德国Aesculap公司）；荧光定量PCR仪（美国Thermo公司）；微孔板迷你离心机（杭州奥盛仪器有限公司）。

1.1.3 主要试剂 免疫组化一抗：兔抗人GHR单克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；二抗：即用型快捷免疫组化MaxVisionTM试剂盒（鼠／兔）（福州迈新生物技术开发有限公司）；TRIzol试剂和引物（美国Invitrogen公司）；逆转录试剂盒（美国Thermo公司）；QuantiFast SyBr Green PCR kit（德国Qiagen公司）；核酸染料（上海赛百盛公司）。

1.1.4 术前准备 患者空腹状态于上午9时前抽取静脉血检查GH均未见异常，闭经者手术时间不受限制，月经减少者在卵泡期手术。

1.1.5 标本采集 两组患者均行宫腔镜检查，在检查中或TCRA操作过程中，视需要在正常子宫内膜组织中，用异物钳钳取适量（质量约20 mg）的内膜组织作为标本。

1.2 检测方法

1.2.1 免疫组化MaxVision两步法 ①取存档蜡块，连续切片4 μm，贴片，65℃温箱烤片2 h，二甲苯脱蜡；②柠檬酸盐缓冲液高压抗原修复，PBS冲洗3次，每次3 min；③免疫组化染色按MaxVision两步法常规流程进行切片中滴加一抗（兔抗人GHR单克隆抗体以1∶400稀释），4℃过夜，PBS冲洗3次，每次3 min，去除一抗后滴加二抗，试剂盒37℃温箱中孵育15 min，PBS冲洗3次，每次3 min；④滴加新鲜配制的DAB显色；⑤清水冲洗，苏木精浅染，清水冲洗还蓝，梯度乙醇溶液脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。以PBS代替一抗作为阴性对照，其余操作流程完全相同。

1.2.2 免疫组化结果判断及半定量分析 将制好的切片置显微镜下观察，每个样本随机选取5个不重叠400倍视野进行测量，阳性信号为棕黄色或棕褐色，根据阳性信号的强弱将结果分为弱、中、强三级，并分别给予1～3分：1分：无信号或信号很弱；2分：信号中等呈淡黄色或棕黄色；3分：信号很强呈棕褐色。根据阳性细胞百分率分别给予1～3分：1分：阳性率≤20%；2分：阳性率21%～70%；3分：阳性率71%～100%。上述两项评分相加作为每例的总积分。结果判定：总积分1～2分为阴性（－），3～4分为阳性（＋），5～6分为强阳性（＋＋）。

1.2.3 qRT-PCR法 ①从子宫内膜组织中提取RNA：取子宫内膜组织约20 mg经液氮研磨后加入1 ml TRIzol裂解；加入0.2 ml氯仿，剧烈震荡；4℃12 000 r／min离心15 min，取上清液，加入等体积异丙醇沉降；4℃、12 000 r／min离心10 min，弃上清液，加入1 ml 75%乙醇溶液；4℃、12 000 r／min离心5 min，弃上清液，干燥RNA沉淀；加入20～50 μl DEPC水，55℃促溶10 min，－80℃保存备用；②RNA的浓度及纯度的测定：分别测定光密度（optical density，OD）值OD260和OD280以计算RNA样品的浓度和纯度；③样品cDNA合成：在0.2 ml无RNase PCR管中，加入总RNA（质量为2 μg）、10 μmol／L Oligo 1 μl、DEPC水补足至12 μl，轻轻混匀、点动离心；PCR仪上65℃加热5 min，立即冰浴3 min；在0.2 ml无RNase PCR管中加入5×Reaction Buffer 4.0 μl、10 mmol／L dNTP Mix 2 μl、RibolockTMRnase inhibitor 1 μl、RevertAidTMM-MuLV Reverse Transcniptase 1 μl；RCR仪上42℃加热60 min，70℃持续5 min，取出上述反应液，即为cDNA，－80℃保存备用；④荧光定量PCR反应（SYBR GREEN方法）：取出上述反应液1 μl作为荧光定量的模板，反应体系如下：2×SYBR Green mixture 5 μl、上游引物（10 μmol／L）和下游引物（10 μmol／L）各1 μl、cDNA 1 μl、无RNA酶水2 μl，总共10 μl。反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性10 s、60℃退火、延伸30 s，共40个循环。本实验所用人类基因扩增引物序列见表1。

表1 本实验所用人类基因扩增引物

1.3 统计学处理采用SPSS 16.0软件进行分析，数据计量资料采用±s表示。qRT-PCR分析所采用的指标为：2－ΔΔCt。计量资料采用两独立样本t检验，计数资料采用χ2检验。

2 结果

2.1 子宫内膜腺体与子宫内膜间质中GHR蛋白表达水平比较免疫组化法检测结果显示：子宫内膜腺体中阳性细胞30例，阴性20例，阳性细胞率为60%；子宫内膜间质中阳性细胞18例，阴性32例，阳性细胞率为36%；两部位GHR蛋白比较差异有统计学意义（χ2＝5.769，P＝0.016）。图1A：PBS阴性对照，子宫内膜腺细胞和间质细胞均呈阴性表现；图1B：研究组GHR蛋白阳性染色主要定位于子宫内膜腺细胞的细胞质中，呈淡黄色（＋），而子宫内膜间质细胞（－）；图1C：对照组GHR蛋白阳性染色定位于子宫内膜腺细胞和间质细胞的细胞膜和细胞质中（主要定位在细胞质）均呈棕褐色（＋＋）；图1B和图1C中GHR蛋白阳性染色都呈弥漫性分布，如风尘状。

2.2 研究组和对照组子宫内膜组织中GHR蛋白表达水平比较免疫组化法检测结果显示研究组GHR蛋白表达水平低于对照组（1.70±0.57 vs 2.77±0.75），两组比较差异有统计学意义（t＝3.373，P＜0.05）。

2.3 研究组和对照组子宫内膜组织中GHR mRNA表达水平比较qRT-PCR法检测结果显示研究组（16例）的GHR mRNA表达水平低于对照组（14例）（0.64±0.21 vs 1.00±0.33），两组比较差异有统计学意义（t＝2.329，P＜0.05）。β-actin、GHR熔解曲线均呈单一峰，并且解链温度在80℃左右，说明产物单一，引物特异性较好，得出的数据可信。见图2。

3 讨论

成熟的人GHR分子是一个含620个氨基酸的单链糖蛋白，其中N端246个氨基酸含5个潜在的糖基化位点，位于细胞外，构成激素结合结构域，C 端350个氨基酸位于胞内，构成信号转导结构域［6］。GH是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种单一肽链的蛋白质激素，是一种具有广泛生理功能的生长调节激素，在女性人体发育时和雌激素一起促进子宫内膜的生长发育。GH发挥功能主要经由两个途径：一是诱导肝细胞、肌细胞产生生长介素（somatomedin，SM），再经由SM间接起作用；二是直接作用于靶细胞产生生理效应［7］。无论哪一种方式GH都需要首先同细胞表面特异性受体结合，即在生理激素浓度下，1分子GH与2分子GHR相结合从而导致受体二聚化［8］，再由GHR介导将信号传入细胞内促进细胞的有丝分裂，加速细胞的增殖，使内膜组织增生［9－10］。

正常情况下子宫内膜在雌孕激素作用下有很强的再生能力，只要内膜基底层不受损伤，或者受损的基底层没有完全形成粗糙面，受损部位的内膜能够很快再生而修复。IUA患者的子宫内膜基底层严重受损，无法再生修复，宫腔部分或全部闭塞，约90%由过度刮宫引起。通过查阅以往的研究［5］，GH研究主要偏于临床，尚缺乏基础研究的证据。本实验同样是在有过宫腔操作史造成子宫内膜受损和血液中GH水平无差异的条件下，研究组GHR表达水平明显低于对照组，并且这种表达在子宫内膜腺体中的表达较多，而在子宫内膜间质中的表达较少。这表明GH有可能是通过促进子宫内膜腺体的增生和发育以增强子宫内膜的厚度和容受性，从而为IUA患者TCRA术后加用GH提供了理论依据，也为临床应用GH治疗IVF-ET中对反应不良性子宫内膜和子宫内膜反应不良性闭经提供了实验证据。但是如果子宫内膜腺体中GHR不足、缺乏或变异，单方面提高GH水平并不能提高子宫内膜的厚度及容受性，相反超生理剂量的GH对GHR有反向调节作用［11］，过量的GH将会阻止了受体二聚化和信息传递甚至可能会增加患子宫内膜癌的风险［12］。

综上所述，研究组GHR表达水平低于对照组，可能是由于研究组患者子宫内膜组织中的GHR水平较低从而使受损的子宫内膜难以修复或异常修复；并且GHR蛋白的阳性表达在子宫内膜腺体中较多，而在子宫内膜间质中表达较少，这表明GH主要是通过与子宫内膜腺体中的GHR结合以促进腺体的增生和发育，达到促进子宫内膜增生和发育的作用。因此临床使用GH治疗IUA时，要充分考虑到GHR的数量，可以探索使用其激素受体激动剂提高受体的数量，来调整药物在IUA治疗过程中使用的剂量，制定符合患者病情的个体化综合治疗方案，本实验因收集样本时间较短，样本数量较少，今后需扩大更多的样本量作进一步研究。

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Expression and significance of growth hormone receptor in the endometrial tissue of intrauterine adhesion patients

Ren Juan，Wei Bing，Song Enxue，et al
（Dept of Gynecology and Obstetrics，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

ObjectiveTo investigate the growth hormone receptor（GHR）expression and significance of endometrial tissue in patients with intrauterine adhesions.MethodsImmunohistochemistry MaxVision twostep and quantitative real-time PCR（qRT-PCR）were used to detect the expression of GHR protein and GHR mRNA IUA in patients endometrial tissue of IUA group（study group）and non IUA group（control group）.ResultsUsing immunohistochemistry assay to detect GHR protein expression and qRT-PCR to detect the GHR mRNA expression，and the differences between the study group and the control group were statistically significant（P＜0.05）.Immunohistochemistry was used to detect the expression of GHR protein in endometrial glands and endometrial stromal，the difference between the two parts were statistically significant（P＜0.05）.ConclusionThe expression of GHR in endometrial tissue in patients with IUA is lower than those of non-IUA，and this expression is more in endometrial glands，less in endometrial stroma，which provide a theoretical reference for the use of hormone in IUA patients after transcervical resection of adhesions（TCRA）.

intrauterine adhesions；growth hormone；growth hormone receptor

R 711.74

A

1000－1492（2015）07－1004－04

2015－03－20接收

国家自然科学基金青年科学基金项目（编号：81100412）

安徽医科大学第二附属医院妇产科，合肥 230601

任 娟，女，硕士研究生；卫 兵，男，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：weibing1965＠hotmail.com