木荷组织培养技术研究

陈碧华 张娟 江斌 邓永生 肖玉梅 张

摘要：对木荷外植体取材母株提前1周喷杀虫剂和杀菌剂，外植体污染率明显降低。加入Vc可以减少外植体褐化，并采用全暗培养。选择MS+BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+Vc 5mg·L-1作为木荷最佳外植体诱导培养基，MS+ BA 0.5 mg·L-1 +NAA 0.1 mg·L-1+Vc 5 mg·L-1+ B2 5 mg·L-1为木荷最佳增殖培养基，1/4MS+IBA 0.25 mg·L-1作为木荷最佳生根培养基。

关键词：木荷;组织培养;外植体诱导培养基;增殖培养基;生根培养基

中图分类号：Q813.1+2文献标识码：A文章编号：1004-3020（2015）01-0016-04

Tissue Culture Technique of Schima superba

Chen Bihua（1，2，3）Zhang Juan（1，2）Jiang Bin（3）Deng Yongsheng（3）Xiao Yumei（3）Zhang Cui（3）

（1.Fujian Academy of Forestry SciencesFuzhou350012; 2. Key Laboratory of Timber Forest Breeding

and Cultivation for Mountainous Areas in Southern China， China Forestry Bureau

Fuzhou350012; Qingliu County Forestry Bureau in Fujian ProvinceSanming365300）

Abstract： The contamination rate of the explants of Schima superba during the process of tissue culture was decreased evidently by pre-treating the stock plants using the pesticides and fungicides before one week in advance. The browning rate of the explants was decreased by adding the Vitamine C and being culured in dark. MS+BA 0.5 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1+Vc 5 mg·L-1 was adopted as the optimal explant induction medium， MS+ BA 0.5 mg·L-1 +NAA 0.1 mg·L-1+Vc 5 mg·L-1+ B2 5 mg·L-1 was adopted as the optimal proliferation medium， and 1/4MS+IBA 0.25 mg·L-1 was adopted as the optimal rooting medium.

Key words：Schima superba;tissue culture; explant induction medium; proliferation medium; rooting medium

木荷Schima superba山茶科木荷属常绿大乔木，为我国南方主要的速生珍贵用材树种与生物防火当家树种，木材用于制作木质家具、木质工艺品、人造板以及木地板。木荷不仅纯林生长与生态稳定性好，而且又是杉木、马尾松等针叶树种良好的混交树种。福建省木荷每年用种量很大，年种植面积达3万hm2以上，年用苗量7 000万株以上，是福建省造林面积最大的乡土树种。长期以来，木荷以实生苗造林，而且长期从福建省外调运种子，由于有性繁殖过程中后代容易性状分离，以致母树优良性状丢失，后代分化严重，个体差异大。组培技术可以弥补有性繁殖带来的缺陷，尤其是经过选育后的优良单株，采用组培快繁技术培育优质種苗，营造高质量用材林和高效防火林带，可以带来显著经济和社会生态效益。

国内仅见广东徐位力等一篇对防火树种木荷组培的简要报道，未见试验数据和统计分析[1]。未见国外有关木荷组培的报道。本研究采用初选的木荷优良单株基部萌芽条作为外植体，不仅可以保持母本优良性状得到遗传增益，而且将来可以为社会提供大量优良木荷苗木。

1材料与方法

1.1材料

供试材料为经过初选的优树基部萌芽条。取其顶芽或半木质化枝条作为外植体。

1.2方法

1.2.1 外植体灭菌

木荷顶芽或枝条作为外植体，很难消毒，尤其是雨季。①对母株不进行任何处理;②对外植体母株预先处理，用有效成分4.5%高效氯氰菊酯乳油1 000倍和40%乐果乳油800倍混合液对母株喷雾，次日用70%甲基托布津可湿性粉剂800倍和80%代森锰锌可湿性粉剂800倍混合液对母株喷雾，在喷药后1周之内见晴天采集外植体。观察外植体污染率。

外植体用自来水冲洗表面5～10 min，再用洗涤粉溶液浸泡15～20 min之后用自来水冲洗干净，然后0.1%新洁尔灭溶液浸泡15～20 min，自来水冲洗干净。在无菌超净工作台上，用70%～75%医用酒精浸泡30 s， 0.1%HgCl2消毒12～15 min， 无菌水冲洗4～5次。切去顶芽基部或茎段上下两端，保留长度约为1 cm左右的带腋芽茎段，接于各种外植体诱导培养基上[2]。

1.2.2培养条件

外植体诱导前2周进行全暗培养，以后光照强度500～1 000 lx;继代培养光照强度1 000～1 500 lx;生根培养光照强度从1 000～1 500 lx增加到炼苗光照3 000～6 000 lx。培养温度为26±2 ℃， 光照时间12 h·d-1。

1.3试验设计

1.3.1外植体诱导

外植体诱导培养基为：①MS+BA 3.0 mg·L-1 +NAA 0.1 mg·L-1+Vc （抗坏血酸） 5 mg·L-1;②1/2MS+BA 3.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+Vc 5 mg·L-1;③MS+BA1.0 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1+ Vc 5 mg·L-1;④MS+BA 0.5 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1+ Vc 5 mg·L-1[3-4]。以上均附加白糖30 g·L-1（“田趣”牌，下同）和卡拉胶（闽南琼胶有限公司出品，下同）6.0 g·L-1，pH6.0。每处理接种50瓶（200 mL广口瓶），每瓶1个芽或茎段，重复3次，培养30 d后统计污染和诱导启动情况。

1.3.2继代培养基

继代培养基为：⑤MS+ BA1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+Vc 5mg·L-1+ B2（核黄素）5mg·L-1; ⑥ MS+ BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+Vc 5 mg·L-1+ B2 5 mg·L-1; ⑦MS+ BA0.1 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+Vc 5 mg·L-1+ B2 5 mg·L-1。以上基本均附加白糖30 g·L-1和卡拉胶6.0 g·L-1，pH6.0。每处理接种30瓶（200 mL广口瓶），每瓶3个茎芽，重复3次，培养30 d后统计增殖系数和茎芽高度。

1.3.3生根培养基

生根基本培养基采用：⑧1/4MS;⑨1/4MS+IBA 0.25 mg·L-1;⑩1/4MS+IBA 0.5 mg·L-1;最后一个1/4MS+ IBA 1.0 mg·L-1。以上基本均附加白糖20 g·L-1和卡拉胶7.0 g·L-1，pH6.0。每处理接种10瓶，每瓶3个茎芽，重复3次。

1.3.4炼苗

培养室培养25 d后的生根苗，移入玻璃温室炼苗约15 d。光照度2 000～6 000 lx。生根接种40 d后统计生根率、根数、根长和高度茎芽。

1.3.5移栽

以红心土做为栽培基质，装入黑色塑料营养袋，移入简易温室中，以0.1‰～0.5‰高锰酸钾消毒土壤。将炼苗后的木荷瓶苗，用自来水洗净植株根部的培养基，70%甲基托布津可湿性粉剂1 000倍液和80%代森锰锌可湿性粉剂1 000倍液混合浸泡10 min消毒后，移栽于营养袋中，覆盖薄膜保湿。每天向叶片喷水1次、浇透水，2周后揭开薄膜，并且每天喷1～3次，以后逐渐过渡到每天喷1次。

采用SPSS11.5软件对试验数据进行单因素方差分析，置信度0.05或0.01。

2结果与分析

2.1外植体灭菌

木荷外植体很难消毒，在外植体母株未预先处理情况下，采用酒精、升汞或次氯酸钠等消毒液进行消毒处理，污染率达到83.3%～100%。加上外植体容易褐化，很难得到无污染而且无褐化的外植体。经过观察分析发现：主要污染原因在于春夏季福州经常下雨，并且木荷苗木上面有很多蚜虫危害。蚜虫以刺吸式口器从苗中吸收汁液的同时，也把微生物带进植株体内，致使外植体内部携带细菌或真菌，外植体消毒时，消毒液难以进入外植体内杀灭细菌或真菌，导致外植体污染率很高。

采用对外植体母株预先处理，即方法（2），外植体污染率降为40.4%～80.0%，外植体无污染率明显提高。

2.2外植体诱导培养基的选择

木荷外植体诱导试验结果见表1。试验中发现外植体褐化严重，因此加入Vc 5 mg·L-1以减少褐化，并采用全暗培养。采用置信度0.05和0.01，分析结果表明：1号培养基平均诱导率为39.2%，2号培养基为13.8%，两者具有极显著差异。这两种培养基除了基本培养基不同，其余激素等添加物完全相同，所以选择1号培养基的MS为基本培养基，淘汰2号培养基。表1结果同时表明：3号培养基平均诱导率为66.3%，4号培养基為68.5%，两者没有显著差异，但3号培养基有愈伤组织产生，导致芽生长缓慢并且伸长困难;而4号培养基无愈伤组织产生，几乎全部芽抽高且生长正常，因此选择培养基④MS+BA 0.5 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1 + Vc 5mg·L-1为木荷外植体诱导培养基。

图1木荷增殖材料

图2木荷生根瓶苗

2.3增殖培养基的选择

在超净工作台上，对诱导成功的木荷外植体，切下新芽，剔除老枝，转接到增殖培养基，试验结果见表2。分析结果表明：5～7号培养基平均增殖率分别为4.3倍、3.2倍和0.7倍，三者之间具有显著差异，对于平均茎芽高度，3种培养基分别为0.8 cm、2.3 cm和3.4 cm，三者之间同样具有显著差异。由于7号培养基平均增殖率太低，5号培养基平均茎芽高度太小，不符合组培工厂化育苗的要求，只有6号培养基MS+ BA 0.5 mg·L-1 +NAA 0.1 mg·L-1+Vc 5 mg·L-1+ B2 5 mg·L-1，在增殖率和茎芽高度方面同时符合组培工厂化育苗技术要求，所以选择该培养基作为木荷增殖培养基。（图1）

2.4生根培养基的选择

将增殖培养获得的木荷有效生根茎芽转接到1/2MS为基本培养基上，经培养室培养25 d，随后炼苗15 ，统计其生根状况，结果（表3）。结果表明：没有添加IBA的8号培养基，没有生根，不能作为生根培养基;9号和10号培养基的平均生根率、平均根条数、平均根长、平均苗高均较理想、而且植株生长正常，但10号培养基的平均苗高为2.8 cm，9号培养基为3.9 cm;11号培养基的平均苗高太低，仅为1.8 m，且生根率较低，仅为57.1%。综上所述，选择9号培养基 1/4MS+IBA 0.25 mg·L-1作为木荷生根培养基（图2）。

2.5组培苗木移栽

木荷组培瓶苗经过15 d炼苗后，洗净培养基后移栽到简易温室，移栽基质为红心土，基质经0.3‰～0.5‰高锰酸钾消毒，移栽后经过覆盖薄膜保湿和注意防治病虫害，30 d后观察成活率达到90%以上。经过表型观察，苗木未见发生变异。

3结论和讨论

（1）确定最佳木荷外植体诱导培养基为：MS+BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1 + Vc 5 mg·L-1;增殖培养基为：MS+ BA 0.5 mg·L-1 +NAA 0.1 mg·L-1+Vc 5 mg·L-1+ B2 5 mg·L-1;生根培养基为：1/4MS+IBA 0.25 mg·L-1。

（2）木荷外植体很难消毒，必须对母株进行预处理，用有效成分4.5%高效氯氰菊酯乳油1 000倍和40%乐果乳油800倍混合液对母株喷雾，次日用70%甲基托布津可湿性粉剂800倍和80%代森锰锌可湿性粉剂800倍混合液对母株喷雾，在喷药后一周之内见晴天采集外植体。外植体污染率降为40.4%～80.0%，外植體无污染率明显提高。试验中发现外植体褐化严重，因此加入Vc 5 mg·L-1以减少褐化，并采用全暗培养。

参考文献

[1]徐位力，苏开君，王伟平，等.防火树种木荷和红木荷的组织培养及植株再生[J].植物生理学通讯，2006，42（2）：55.

[2]谭文澄，戴策刚. 观赏植物组织培养技术[M]. 北京：中国林业出版社，1991，40-44.

[3] 陈碧华.杂交马褂木组织培养技术研究[J].湖北林业科技，2012，（3）：10-13.

[4]Chen B H.In vitro propagation of a medicinal plant： Tripterygium wilfordii Hook f.[J].Forestry studies in China，2009，11（3）：174-178.

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[6] Trueman S J，Hung C D .Cytokinin concentrations for optimal micropropagation of Corymbia torelliana × C. citriodora[J].Australian Forestry，2012，75（1）： 233-237.

[7]陈碧华，李乾振，吴丽君，等.巨桉组织培养及工厂化育苗技术的研究[J].福建林业科技，2006，33（1）：61-63，79.

（责任编辑：郑京津）

基金项目：福建省属公益类科研院所基本科研专项（闽林研〔2012〕25号）;福建省林业厅科研项目“木荷优良单株选择与组培技术研究”（闽林科〔2012〕 3号）。

作者简介：陈碧华（1967～），男，福建龙海人，博士，教授级高级工程师，主要从事林业生物技术研究工作。