UPLC—MS/MS测定动物源性食品中氯霉素的含量

赵飞 高广慧 崔松林

【摘 要】 本文阐述了建立超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）检测动物源性食品中氯霉素含量的分析方法。该方法快速、准确，灵敏度高，适用于动物源性食品中氯霉素的检测。

【关键词】 UPLC-MS/MS 氯霉素 动物源性食品

【DOI编码】 10.3969/j.issn.1674-4977.2015.11.006

氯霉素是一种广谱、强效抗生素，常被非法用于养殖业中。氯霉素一般较为稳定，不易降解，且其具有诱变、致癌的特性，及对人体造血机能产生严重的毒副作用，因此被世界多数国家列为禁用物质。我国食品动物禁用兽药清单中，氯霉素位列其中。因此氯霉素的高灵敏检测对于保证动物源性食品的安全等具有重要意义。

常用的氯霉素检测方法有液相色谱法及液相色谱-串联质谱法等。本文通过优化样品前处理条件及色谱-质谱条件，建立了动物源性食品中氯霉素残留的检测方法，本方法可为动物源性食品中氯霉素残留的定性定量分析提供有力的技术支撑，亦可以为动物源性食品中其他兽药残留的检测分析提供借鉴。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

WATERS TQD超高效液相色谱-串联四级杆质谱联用仪（美国沃特世公司）；涡旋混合器（德国IKA）；氮吹浓缩仪（上海屹尧仪器科技发展有限公司）。

标准品：氯霉素（chloramphenicol， CAP），氘代氯霉素（D5-chloramphenicol，D5-CAP）。

乙腈（色谱纯，美国FISHER公司），正己烷（色谱纯，美国FISHER公司），实验用水为一级水。

1.2 标准溶液的配制

分别精密称取适量氯霉素和氘代氯霉素标准物质，以甲醇为溶剂配制质量浓度为1.0mg/mL的标准储备溶液，置于棕色容器中，于-18℃冰箱中保存。将上述储备溶液分别用甲醇逐级稀释成浓度为100ng/mL的标准使用液，用于优化质谱参数。以10%甲醇溶液为溶剂将标准使用液稀释配制为含有氘代氯霉素的质量浓度为2ng/mL的标准系列溶液。

1.3 样品前处理

（1）提取准确称取匀质后的动物源性食品5.0g（精确至0.01g），分别加入相当于10ng的氘代氯霉素标准使用液，置于50mL带有螺旋盖的离心管中，精密加入25mL乙酸乙酯，1mL氨水，涡旋提取30s，加入无水硫酸钠5g，涡旋30s后，于5000r/min离心10min。

（2）浓缩：精密移取上清液10mL于另一离心管中，40℃下空气流吹干。

（3）复溶：残渣用2mL10%乙腈溶液，涡旋1min，再加入1mL正己烷，涡旋混合，静置待分层后，取下层经0.22μm滤膜过滤后待测。

1.4 UPLC色谱条件

Waters超高效液相色谱柱：ACQUITY UPLC BEH1.7μm2.1×50mm；流动相：乙腈（A），水（B），梯度洗脱程序见表1；柱温：30℃；样品室温度：10℃；进样体积：5μL；流速：0.4mL/min。

表1 梯度洗脱程序

1.5 MS/MS质谱条件

离子化方式：电喷雾离子化；扫描方式：负离子模式；监测方式：多反应离子监测；毛细管电压：2.5kV；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气流量：800L/h；锥孔反吹气流量：50L/h；质量条件参数见表2。

表2 MRM分析的质谱参数

2 结果与讨论

2.1 液相色谱条件的选择

本文中氯霉素的检测采用超高效液相色谱质谱联用仪，选用色谱填料粒径为1.7μm的C18超高效液相色谱柱，与常规的色谱柱相比，因粒径大大减小，使单位体积填料的表面积大大增加，进而增加了理论塔板数，柱效明显优于普通色谱柱，色谱分离时间大大降低，提高了分析检测的速度。

2.2 质谱条件的选择

取标准使用液作为进行质谱条件选择的测试液，根据氯霉素的结构和性质，选择电喷雾离子化负离子扫描模式，对毛细管电压、脱溶剂气流量、通过一级全扫描观察总离子流图，找到精确的分子离子峰，优化锥孔电压等条件使分子离子峰响应最好；在上面基础上，通过逐步增加碰撞能量，找到精确的子离子，氯霉素的分子离子峰为[M+H]+（m/z320.9），选择子离子151.9和256.9分别作为定量离子和定性离子，氘代氯霉素的分子离子峰为326.1，选择157.0作为内标离子。通过优化碰撞能量、锥孔电压等参数，使各子离子的灵敏度达到最优，定量分析多反应离子监测的最优化参数见表2。

2.3 方法的线性及标准曲线绘制

氯霉素标准系列浓度依次为0.5、1、2、4、8（ng/mL），内标物氘代氯霉素的浓度为2ng/mL，依次进样测试，进样量均为5μL，经工作站软件计算各子离子峰面积及氯霉素定量离子与氘代氯霉素定量离子的峰面积比值，并绘制标准曲线，采用内标法定量，得到回归方程为Y=0.667X-0.026，相关系数r=0.9995（见图1）。

图1 氯霉素标准曲线（内标法）

2.4 方法的检出限

以产生3倍信噪比时的样品中氯霉素的浓度为最低样品检出限，得到本方法的样品最低检出限为0.05μg/kg（见图2）。

图2 本法样品最低检出限的信噪比

2.5 方法的精密度和准确度试验

以样品响应值低于样品最低检出限的样品作为本底样品6份，分别加入一定浓度的标准溶液及内标溶液，按样品前处理方法进行处理，进样测试，分别计算回收率和精密度，得出回收率在95%～110%之间，RSD小于5.0%，测定结果见表3。

表3 方法的精密度和准确度试验（n=6）

2.6 实际样品的测定

以购买的产品编号为ERM-BB130猪肉中的氯霉素含量质控样品作为测试样品，证书给出的氯霉素参考值范围是（0.209～0.251）μg/kg，按本法检测结果为0.240μg/kg，检测结果在证书的参考值范围内，结果满意。

3 小结

本文采用超高效液相色谱-串联四级杆质谱法检测动物源性食品中氯霉素含量具有以下优势：超高效液相色谱完成氯霉素的测定仅需3min，极大缩短了分离分析时间，且低流速可以减少流动相的消耗，降低成本；样品的前处理并没有经固相萃取柱净化直接进样，操作简便快速，并以内标法定量准确度较高，适用于大批量样品的检测；电喷雾三重四级杆多反应离子监测选择性更好，抗干扰能力更强，方法的灵敏度更高。

参考文献

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作者简介

赵飞，工程师，硕士，主要从事食品和化妆品检测方法开发与研究工作。

高广慧，硕士，从事食品和化妆品检测方法开发与研究。

崔松林，学士，从事食品和化妆品检测方法开发与研究。

（责任编辑：张晓明）