高粱遗传转化研究进展

张微 王良群 刘勇 郝艳芳 杨伟 白鸿雁 武擘

摘要 介绍了农杆菌介导法、基因枪法、电激法、花粉管通道法4种高粱遗传转化方法，并提出了今后高粱遗传转化中应集中研究的问题。

关键词 遗传转化；高粱；研究进展

中图分类号 S514；Q813.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）27-387-03

Advances in the Genetic Transformation of Sorghum bicolor

ZHANG Wei， WANG Liang-qun， LIU Yong et al

（Sorghum Research Institute of Shanxi Academy of Agricultural Sciences， Jinzhong， Shanxi 030600）

Abstract Four methods of the genetic transformation of sorghum were introduced， including Agrobacterium mediated transformation， particle bombardment， electroporation， pollen-tube pathway， some suggestions for research into the genetic transformation of Sorghum were put forward.

Key words Genetic transformation； Sorghum； Research progress

高粱是全世界仅次于小麦、水稻、玉米、大豆和马铃薯等的重要作物之一，是粮食、饲料和酿酒业原料的重要来源，尤其是对于亚洲和非洲的发展中国家[1-2]。其作为一种C4植物，光合效率非常高，生长期较短（约4个月），水分需求量低，对盐碱和干旱都有较强的抵抗力和适应能力[3-4]。但由于高粱的种质资源缺乏和有性杂交不亲和等原因，采用传统育种方法限制了它的遗传改良，采用基因工程可以将新基因导入高粱，为其遗传改良提供了新的途径[5-7]。但植物转基因技术一般依赖于植物高频率再生体系的建立。尽管高粱很早就开始了遗传转化方面的研究，但被公认为是遗传转化最困难的作物之一，与其他具有重要经济价值的和本科作物如水稻、小麦和玉米相比，其遗传转化的研究工作进展相对缓慢[8-9]，但已取得一些成果。笔者总结了近年来有关高粱遗传转化的研究进展，详细介绍了遗传转化的概念、几种已在高粱上成功应用的遗传转化方法，并展望了今后研究中的问题，以期为高粱，尤其是甜高粱的遗传转化提供参考。

1 高粱遗传转化的概念

高粱的遗传转化是指将外源基因转移到高粱体内并稳定的整合表达与遗传的过程。在该过程中，建立高效、稳定的遗传转化体系是实现转化的先决条件。不同品种，甚至是同一品种不同基因型其转化体系也有很大的差异。在高粱遗传转化研究中，用于外源基因导入的方法有农杆菌介导法、基因枪法、电激法、花粉介导的超声波转化法等，每种方法都有其各自的特点[10]。上述方法已在高粱上应用，并取得进展。

2 高粱遗传转化的方法

2.1 农杆菌介导法

农杆菌介导法是利用农杆菌的天然侵染过程，实现外源基因转移和整合的方法。用于遗传转化的农杆菌一般是广泛寄生于双子叶植物和裸子植物的土壤杆菌属（Agrobacterium）细菌。它是人们在两类土壤细菌——根癌农杆菌（Agrobacterium tumefacines）和发根农杆菌（A.rhizogenes）中发现的。一般情况下，农杆菌不侵染单子叶植物，但近来有研究表明，对单子叶植物也有侵染力。农杆菌介导法首先在玉米和水稻中获得了成功。随后有学者利用农杆菌在高粱的遗传转化中侵染高粱的分生组织获得了成功[11]。Zhao等[12]利用农杆菌介导法，首次用高粱的幼胚作为受体材料，将外源基因uidA基因和bar基因导入高粱，成功地获得了转基因植株。Seetharama等[13]发现水稻中的chitinasG11和tlp 2个PR基因对镰刀霉茎腐病有抗性，利用农杆菌介导法将该2个基因转到高粱自交系中，得到的后代对镰刀霉茎腐病有中度抗性。在国内也有学者利用农杆菌介导法进行高粱遗传转化成功的报道。张明洲等[14]利用高粱幼穗的愈伤组织作为受体材料，通过含有gus基因和抗潮霉素的双元载体将杀虫晶体蛋白基因cry1Ab导入高粱品种5-27、ICS21B和115中，最终获得了21个独立转基因植株，转化率为1.90%。朱莉等[15]通过农杆菌介导法用甜高粱幼穗愈伤组织为转化受体，将密码子优化过的Btcry1Ah导入MN-3025和BABUSH 2个甜高粱品种中，最终获得了66 株再生植株，经PCR鉴定其中有22株为阳性植株，转化率为2.38%。朱莉等[9]还发现Btcry1Ah基因对玉米螟有抗性，将其导入高粱品种中，表现出一定的抗性。肖军等[16]通过农杆菌介导法，将杀虫晶体蛋白基因cryAb基因导入高粱中，成功地获得了转基因植株。张明洲等[14]发现cry1Ab基因有杀虫的作用，利用高梁幼穗愈伤组织将其导入3个品种中，得到抗大螟（Sesamia inferens）的转基因高梁植株。

总的来说，该方法十分简单，而且效果良好，为植物利用外植体作为材料进行遗传转化提供了一种新的方法。许多研究学者相继在不同的植物上獲得了许多转基因植株，其中80%都是通过农杆菌介导法获得的，截止目前已经超过200种。农杆菌介导法已成为植物遗传转化中最主要和最普遍的方法。但该方法的成功取决于受体材料、农杆菌菌株、培养基、vir区基因等多种因素。

2.1.1 受体材料的选择。

受体材料的选择是利用农杆菌介导法进行高粱遗传转化体系能否成功建立的关键因素，研究表明其必须具有较高的遗传稳定性和再生能力，还要测定它对选择抗生素和农杆菌的高度敏感性。从成功获得转基因植株的实例可以看出高粱的茎尖、叶片、幼胚、成熟胚以及幼穗所诱导的愈伤组织都是高粱理想的受体材料，其中高粱的幼穗的高效再生能力最强，但其采收又受到了季节的限制，不能随时取材。刘宣雨等[17]通过甜高粱幼穗诱导的愈伤组织进行再生培养，成功获得了稳定的再生体系。Lu等[18]在研究如何提高高粱中的赖氨酸含量时，以高粱未成熟胚为对象，利用农杆菌介导法，选取来自拟南芥的经过优化处理的tRNAlys基因和高粱的1ys1tRNA合成酶元仲基因，转入高粱组织中，后代经检测为转基因再生植株。此外，肖军等[19]研究表明，对受体材料进行预处理，可以提高高粱的转化效率。

2.1.2 农杆菌菌株。

根据携带不同Ti质粒的根癌农杆菌诱导的冠瘿瘤所产生的冠瘿瘤类型，将根癌农杆菌分为农杆碱型、胭脂碱型和章鱼碱型3种。同理，根据携带不同Ri质粒的发根农杆菌诱导的冠瘿瘤所产生的冠瘿瘤类型，将发根农杆菌分为黄瓜碱型、甘露碱型和农杆碱型3种。上述6种不同类型的农杆菌所携带的Ti质粒或Ri质粒的DNA片段可以整合到植物的基因组中，该片段叫做转移DNA。不同菌株对同一植物的转化效率有很大的差别，是由于不同的农杆菌菌株具有不同的宿主范围[17]。肖军等[19]研究表明，在农杆菌介导高粱遗传转化过程中，最适宜的菌液浓度（OD600值）为0.5～0.7，共培养培养基的最佳温度为22～25 ℃，最佳pH是5.2～5.6，最佳共培养时间是3 d，乙酰丁香酮的浓度为100 μmol/L时高粱愈伤组织遗传转化达到最佳效果。

2.1.3 培养基的选择。

在农杆菌介导高粱的遗传转化过程中，共培养的培养基成分要利于高粱细胞旺盛生长和持续的分裂状态，更要有利于农杆菌的高效转染。有研究表明，共培养的培养基成分与不定芽诱导的培养基相同[7]。Carvalho等[20]研究表明，在共培养中添加椰子汁，可以提高植株外植体的成活率。

2.1.4 vir区基因的活化。

大多数植物组织在受到创伤后，植物细胞便会分泌一些酚类化合物，这些酚类化合物可以诱导vir区基因的活化，使农杆菌转化得以实现。科学家首先从烟草的愈伤组织、根和叶中提取到羟基乙酰丁香酮（OH-AS）和乙酰丁香酮（AS），并且证明它们能促进vir区基因的活化。此外，研究中也发现植物中的其他酚类化合物如对羟苯甲酸、没食子酸、儿茶酚和3，4-二羟苯甲酸等均可使vir区基因活化，但其中最有效的是乙酰丁香酮。肖军等[19]研究表明，乙酰丁香酮的浓度为100 μmol/L时高粱愈伤组织遗传转化达到最佳效果。Zhao等[12]也得出研究结论，在农杆菌介导高粱遗传转化过程中，乙酰丁香酮为100 μmol/L时使高粱达到最大转化率。乙酰丁香酮一般有2种用法：一是在培养农杆菌液体时加入，一般在配制侵染液前4～6 h加入。此时的农杆菌处于对数生长期，又处于vir区基因高度活化状态，可提高农杆菌的侵染能力。二是加在共培养的培养基中。

2.2 基因枪法

基因枪法，又名微粒轰击法。基因枪转化就是通过高速飞行的金属颗粒将包被其外的目的基因直接导入到受体细胞内，从而实现遗传转化的一种方法。基因枪可分为3种类型：一类是以火药爆炸力作为动力；一类是以高压气体作为动力；一类是以高压放电作为动力。无论哪类基因枪，其基本原理相同。即利用火药爆炸力、高压放电或机械加速的金属颗粒来轰击受体细胞。先将外源DNA溶液与钨、金等金属微粒共同保温，使DNA吸附在金属颗粒表面，然后用各种动力加速金属颗粒，使之直接射入受体植物细胞，外源遗传物质随金属颗粒进入细胞内部，导致植物发生可遗传的变异。Casas等[21]首次报道了利用基因枪法成功地将抗除草剂基因导入高粱中，以高粱的未成熟胚作为受体材料，利用包被pat基因的钨弹（DPuont no.75056）、bar基因、nptll基因和金弹（Adlrich no.32，658-5）进行轰击，结果表明在600个受轰击的幼胚中，有2个获得了转基因植株，并稳定遗传给后代。Tadesse等[22]试图提高高粱中的赖氨酸含量，其通过基因枪法将dhdps-r1基因导入到未成熟胚和茎尖中，获得10株植株，经检验为转化株，但后代中的赖氨酸含量较对照没有提高，其原因有待进一步研究。

在高粱中利用基因枪法转化成功的报道较多，如Kononowicz等[23]在1995年报道，用基因枪法将bar基因转化入高粱幼穗诱导产生的愈伤组织。此后有大量类似的报道。但研究发现利用基因枪法将bar基因导入高粱后，受体材料虽具有双丙氨膦抗性，但得到的体外培养组织很少[24]。

来自大麦的HVA1基因在植物体遇到干旱、盐碱和极端温度等逆境胁迫下能够大量积累某种特异性的蛋白，与植物的抗逆能力相关。为了提高高粱抗旱能力，有学者将该基因利用基因枪法导入高粱栽培的茎尖中，获得了转基因植株，抗旱能力表达较弱[16]。mtlD基因能够提高植物对水压和盐分的耐受能力，其机理是诱导甘露醇的大量合成，印度学者曾试图将该基因导入高粱，获得耐盐能力高的高粱品种[25]。Zhu等[8]利用基因枪法将水稻的chitinase基因和bar基因导入高粱染色质中，后代表现出抗菌、抗除草剂，并能够稳定地表达。石太渊等[26]试图将小麦中的（HMW）谷蛋白基因1Ax1导入高粱中，后代子粒中的面筋含量有一定的提高。

虫害对高粱威胁较大，每年因为虫害造成的高粱减产约10亿美元[27]。为了解决上述问题，Girijashankar等[28]用基因枪法将抗条螟（Chilopartellus swinhoe）的3个基因导入高粱的茎尖中，以期提高高粱抗性。结果表明，与对照相比，转mpiC1-cry1Ac基因的后代对C.partellus初龄幼虫有一定抗性，而其他2个转基因株系的抗性很低。朱莉等[9]将对玉米螟有较高抗性的抗虫转基因导入到高粱品种中，初步获得了对玉米螟有较高抗性的高粱植株。

綜上可见，影响高粱基因枪法成功的因素较多。首先，受体材料的调选及再生体系的建立是最关键的条件之一。其次，在微弹轰击之后，其细胞组织受到损伤，再生能力较强的影响小，而再生能力较差的影响大，这是基因枪法无法避免的危害。因此，为了提高DNA转化效率，应对该方法进一步进行优化，如微弹的类型及大小、包被DNA后对微弹进行监测、受体材料抗损伤能力及再生能力等。

2.3 电激法

电激法诞生在20世纪80年代初。其原理是对细胞实施高压脉冲，在细胞膜上打出一些小孔，外源的DNA等遗传物质通过小孔进入细胞核，这些小孔在一段时间后能自行愈合，最终完成转化。吴乃虎[29]最早将氯霉素乙酰转移酶基因转到胡萝卜、玉米、烟草上，获得成功。Toriyama等[30]利用该法在水稻上获得成功。Ou-Lee等[31]于1986年首次尝试将电激法在高粱上使用，他将编码氯霉素乙酰转移酶基因导入高粱中，并检测了转化结果。Battraw等[32]也用电激法将nptII基因以及uidA基因导入高粱中，得到77个抗卡那霉素愈伤组织，但未培养出再生植株。

电激法的特点是简单高效、费用低廉、不需精密的设备，但缺点是转化率、成功率低，因为对原生质体的培养难以成功，目前应用较少。在高粱转基因初期的研究中，研究者均未获得成功，所有该方法尚未有人应用。

2.4 花粉管通道法

花粉管通道法是指将正常授粉的花柱切割后，将外源DNA等遗传物质涂摸在花柱上，伴随花粉萌发DNA进入细胞内并整合的方法。国内杨立国[33]最早以高粱ICS-12B为对象，将高粱IS7518C基因的总DNA与BTAM428基因的总DNA混合后，通过该法进行转化研究，F5代得到稳定表达的品系23个；随后将大豆DNA成功导入高粱的恢复系中，获得的后代的品质比对照大幅提高。Wang等[34]于2007年对该法提出改良，即花粉介导的超声波转化法，其法利用超声波辅助处理植物细胞，其原理是利用强脉冲超声波击穿细胞膜后，细胞膜出现小孔洞，这些小孔洞会自动愈合，与电激法类似，外源DNA等遗传物质通过小孔洞能进入细胞内。他们将含nptII和uidA基因的载体先与高粱的花粉混合，在0.3 mol/L蔗糖溶液中浸泡，給予适度的超声波处理。然后将花粉涂抹于高粱雄性不育系的柱头上，并成功获得转化材料。通过检测，发现上述基因已整合到高粱的正常基因组序列中，得以表达。国内相关研究起步较晚，但也有进展。石太渊等[26]利用花粉管通道法将PYH157基因导入高粱，得到4个较抗病的植株。

该法操作简单、周期短，能避免由于长期组织培养引起的体细胞变异。另外用超声波处理可以提高成功率，所以仍被一些研究者使用。但其缺点是很难控制转化基因的拷贝数。

3 展望

由于高粱种质资源中遗传范围狭窄以及因自交不亲和性，利用远缘杂交得到新的变异成功率极低，所以利用传统育种技术改良高粱品种的产量、品质抗病性均不理想。由于遗传转化技术能将其他种属的优良农艺性状整合在高粱基因组中，其后代多具有较高的产量、抗病虫害性、抗逆性及品质，已被大多数育种家所认同，可以说遗传转化技术将成为国内外高粱遗传育种的首要目标。

虽然高粱转基因研究工作已取得进展，但相比其他作物仍有差距。其遗传转化面临的问题主要有：①组织培养方面，如培养基的配方、取材的时间与部位、克服再生效率低等。②寻找新的高效转化方法。③在培养的过程中有些基因稳定的表达和去除嵌合体等。随着对其遗传机理、各种方法研究的不断深入，高粱遗传转化研究工作今后会取得更大的发展。

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