球孢白僵菌Bb01菌株的生物学特性

钱晶晶 迟德富 丁俊男

摘要 [目的]探索高致病白僵菌受自然环境影响条件下的生物学特性。[方法]研究外部环境条件对球孢白僵菌Bb01生长的影响及对青杨脊虎天牛幼虫致病力的影响。[结果]球孢白僵菌Bb01菌株的最适培养基为改良马丁氏培养基，菌落生长和产孢的最优培养温度为26 ℃，最佳湿度为100%，菌落的生长和孢子产量随着紫外线照射时间的延长而减少；球孢白僵菌Bb01对青杨脊虎天牛成虫的致病力不高，仅为16.67%；26～28 ℃条件下对青杨脊虎天牛幼虫的致病力最大，致死中时（LT50）分别为2.23和2.58 d，湿度在100%时致病力最大，LT50为2.57 d；通过虫体传代白僵菌可增强菌株的致病力。[结论]试验结果为提高病原真菌的适应性和生产实践提供了理论依据。

关键词 球孢白僵菌；青杨脊虎天牛；生物学特性

中图分类号 S763.304.4 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）27-374-06

Biological Characteristics of Beauveria bassiana Bb01 Strain

QIAN Jing-jing， CHI De-fu， DING Jun-nan*

（Northeast Forest University， Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract [Objective] The aim was to biological characteristics of B.bassiana Bb01 strain under different culture conditions. [Method] Effects of external environment conditions on the growth of B. bassiana Bb01 strain and pathogenicity to Xylotrechus rusticus L. were studied. [Result] The improved Martins medium was suitable for the growth of Bb01 strain in B. bassiana. The best temperature and humidity for spores growth and production were 26 ℃ and 100%. The growth and production of spores were decreased with the extension of UV exposure. The virulence of Bb01 strain to X. rusticus adult was low， only 16.67%. The highest virulence to X. rusticus larvae appeared under 26 ℃ and 28 ℃， the LT50 values were 2.23 d and 2.58 d， respectively. On the other hand， Bb01 strain showed the highest virulence to X. rusticus larvae at relative humidity 100% and LT50 was 2.57 d. Strain virulence could be increased by spread of X. rusticus larvae. [Conclusion] The results provide theoretical basis for improving adaptation of pathogenic fungi.

Key words Beauveria bassiana； Xylotrechus rusticus L.； Biological characteristics

白僵菌作为重要的微生物防治手段，在我国已基本上具备工业化生产条件，白僵菌入侵寄主体内或者在寄主体表形成孢子时，都需要适宜孢子成长的温度和高湿条件。白僵菌具有寄主专化性，致病力主要受菌株的感染能力、对虫体和虫态的适应能力和自然因素变化等条件制约[1]。东北三省是青杨脊虎天牛的主要危害区，该虫呈逐渐严重趋势，传统化学农药防治虽能起到一定效果，但同样污染周边生态环境，因此，寻找一种可持续、无公害的防治方法已成为现在学者的研究重点。白僵菌的寄生性十分广泛，但长期寄生在同一宿主上就会产生喜嗜性，通过对白僵菌进行定向培养可提高对某一昆虫的致病力和专一性，从而有效增加防治效果。球孢白僵菌是重要的生物防治病原真菌之一，目前被广泛应用到林业和农业害虫防治实践中。自然环境中白僵菌对害虫的侵染受立地条件（温度、湿度、光照、风雨等）等因素的制约[2-3]，了解环境因素及其对白僵菌致病力的影响具有生产实践意义。目前关于环境因素对白僵菌侵染青杨脊虎天牛影响的研究尚未见报道。

鉴于此，笔者前期从多种白僵菌中筛选出对青杨脊虎天牛具有高毒力的球孢白僵菌菌株Bb01，研究了外部环境条件影响白僵菌的生长因素和对青杨脊虎天牛幼虫致病力的影响，以期为提高病原真菌的适应性和生产实践提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株。

试验于2014年5～7月在东北林业大学森林病虫害生物学国家林业局重点开放实验室进行。供试菌种为从青杨脊虎天牛上采集的球孢白僵菌Bb01菌株，将菌株培养在试管PDA斜面培养基上10 d后备用。

1.1.2 植物材料与药剂。

马铃薯为市售；琼脂、硫酸铁、硫酸镁和蛋白胨购自天津市致远化学试剂有限公司；硝酸钠购自上海之臻化工有限公司；蔗糖购自天津市博迪化工股份有限公司；葡萄糖和酵母膏购自北京奥博星生物技术有限责任公司；麦芽糖购自广东省广州市酷泰贸易有限公司；磷酸氢二钾购自河北省廊坊天科生物有限公司；氯化钾购自上海国药集团；硫胺素购自国药集团化学试剂有限公司，药品均为分析纯。

1.1.3 仪器。

LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗仪器厂）、XMTD-4000型电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）、TGL-16G型台式离心机（上海安亭科学仪器厂）、PH070A型恒温培养箱（上海益恒实验仪器有限公司）、HDL型无菌操作台（北京东联哈尔滨仪器制造有限公司）。

1.1.4 供试培养基。

改良马丁琼脂培养基（Martin）：马铃薯汁1 000 ml、葡萄糖20.00 g、KH2PO4 3.00 g、MgSO4·7H2O 1.50 g、硫胺素8 mg、琼脂20.00 g。

察氏琼脂培养基（Czapek）：NaNO3 3.00 g、K2HPO4 1.00 g、MgSO4·7H2O 0.50 g、KCl 0.50 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、蔗糖30.00 g、琼脂15.00 g、蒸馏水1 000 ml；

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯汁1 000 ml、葡萄糖20.00 g、琼脂20.00 g；

马铃薯蛋白胨琼脂培养基（PPDA）：马铃薯汁1 000 ml、蛋白胨10.00 g、葡萄糖20.00 g、琼脂20.00 g；

萨氏葡萄糖酵母琼脂培养基（SDAY）：蛋白胨10.00 g、葡萄糖40.00 g，酵母膏2.00 g、琼脂20.00 g、蒸馏水1 000 ml；

萨氏麦芽糖酵母琼脂培养基（SMAY）：蛋白胨10.00 g、麦芽糖40.00 g、酵母膏2.00 g、琼脂20.00 g、蒸馏水1 000 ml。

1.2 方法

1.2.1 培养基质对Bb01菌株营养生长的影响。

选用Martin、PDA、PPDA、Czapek、SDAY和SMAY 6种配方配制平板培养基，各培养基均在高温（121 ℃蒸汽）、高压（0.1 MPa）下灭菌20 min。无菌条件下用刮铲刮取球孢白僵菌菌株Bb01孢子，置于各培养基中心位置上（培养皿直径为90 mm），封口膜密封后置于恒温培养箱（26 ℃、相对湿度大于85%、无光照）中培养10 d，每天观察生长情况并测量记录菌落直径，每个处理5次重复，筛选最适培养基质。

1.2.2 温度对Bb01菌株生长的影响。

参照潘志平等[3]的方法并略作修改，参照“1.2.1”方法接种。将球孢白僵菌Bb01菌株接种于改良马丁琼脂培养基上，分别培养在不同温度环境下，设定恒温培养箱为14、20、26、28和32 ℃，相对湿度大于85%、无光照培养10 d，每2 d测定菌落直径并记录，每个处理5次重复。10 d后统计产孢量，取培养皿中心位置约5 mm的菌块，放入0.1%吐温-80无菌水中，漩涡振荡后配成孢子悬浮液，用血球计数板测定计算产孢量，每处理3次重复。

孢子数的计算方法：

1 cm2菌落孢子量=（平均每小格孢子量×4×106×稀释倍数）/（3.14×0.16）

安徽农业科学 2015年

1.2.3 湿度对Bb01菌落生长的影响。

参照王宝辉[4]的方法并略作修改，参照“1.2.1”方法接种。将球孢白僵菌Bb01菌株置于改良马丁琼脂培养基上，设定恒温培养箱湿度为100%、85%、75%和65%，温度为26 ℃，无光照恒温培养箱中培养10 d，每2 d测量菌落直径并记录，每个处理5次重复。产孢量测定方法参照方法“1.2.2”。

1.2.4 紫外照射对Bb01菌落生长的影响。

参照卢振起[5]的方法并略作修改，菌株接种方法参照“1.2.1”。将球孢白僵菌Bb01菌株置于改良马丁琼脂培养基上培养。在超净工作台内距30 W紫外线灯50 cm下照射15、30、45、60、75、90和120 min后放入恒温培养箱（26 ℃，相对湿度大于85%，无光照）培养10 d，以正常培养不照紫外线作为对照（CK），每2 d观察白僵菌菌落生长情况并记录，每个处理5次重复。产孢量计算参照方法“1.2.2”。

1.2.5 球孢白僵菌Bb01对青杨脊虎天牛成虫的侵染。

选取体态健康完整、行为活跃的青杨脊虎天牛成虫，用无菌水清洗体表，喷洒3 ml配制好的孢子悬浮液在1～10 d日龄青杨脊虎天牛成虫体后放入养虫笼中，每笼不分雌雄隨机放入6头成虫，在养虫笼中放入新鲜杨树枝条并每日更换，保持水分，试验共5个重复，每日观察感染情况并记录死亡情况，将死虫收集保湿处理保存在人工培养箱[26 ℃、相对湿度为（75±10）%、无光照]中，镜检观察死虫体表是否有菌丝附着以确定为白僵菌感染致死，无菌丝附着则确定为非白僵菌致死。另设用0.1%吐温-80无菌水喷洒在成虫身上作为对照处理，共随机处理10头成虫。

1.2.6 温度对球孢白僵菌Bb01菌株侵染力的影响。

采用“孢子浴”法，选取龄期一致、体态健康的青杨脊虎天牛幼虫浸入配制好的孢子悬浮液中30 s后放入无菌养虫盒（放置含水无菌脱脂棉球以保持水分）中，放入不同温度环境下，设定恒温培养箱为14、20、26、28和32 ℃[相对湿度为（75±10）%、无光照]，每个温度处理15头幼虫。每天观察白僵菌感染和死亡情况，虫尸保湿处理在人工培养箱[26 ℃、相对湿度为（75±10）%和无光照]中，并在镜检下确定是否为球孢白僵菌感染，记录并计算死亡率和LT50。

死亡率=（处理虫数-活虫数）/处理虫数×100%

1.2.7 湿度对球孢白僵菌Bb01菌株侵染力的影响。

侵染参照“1.2.6”方法，将龄期一致的青杨脊虎天牛幼虫浸入浓度为1×108个/ml的孢子悬浮液中45 s后放入无菌养虫盒（不放饲料）中，然后将养虫盒放入人工培养箱培养，将人工培养箱（28 ℃、无光照）设置4个不同湿度梯度（100%、90%、80%和70%），每日观察幼虫的死亡情况并记录，每个处理15头幼虫，3次重复，收集虫尸保湿处理培养在人工培养箱[26 ℃、相对湿度为（75±10）%、无光照]中，并在镜检下确定是否为球孢白僵菌感染，统计累计死亡率和LT50。

1.2.8 菌株传代方式对侵染力的影响。

将原始菌株作为初始一代S1，将S1代用0.1%吐温-80无菌水配制成浓度为1×108个/ml的孢子悬浮液，对青杨脊虎天牛幼虫进行侵染试验，从感染虫体上取孢子并培养在改良马丁氏培养基上，培养产生的分生孢子定义为F1代，并制成浓度为1×108个/ml的孢子悬浮液继续对幼虫进行侵染试验，并取虫体感染孢子培养得F2代，以该方法类推取得F3代，每代供试15头青杨脊虎天牛幼虫，每个处理3次重复。

将S1代培养在改良马丁氏培养基上，待培养15 d后取其孢子培养在改良马丁氏培养基上并定义为S2代，依该方法类推取得S3代，将各代培养的菌株配成浓度为1×108个/ml的孢子悬浮液，每代供试15头青杨脊虎天牛幼虫，将幼虫浸在孢子液中40 s后放在无菌养虫盒中，每个处理3次重复，共处理10 d。置于恒温培养箱中，每天观察其死亡情况并记录，计算死亡率和LT50。

1.2.9 数据处理。采用DPS和Excel软件处理数据，使用时间-剂量死亡率分析模型LT50和致死中浓度（LC50）以及95%置信区间；采用SPSS 17.0软件进行方差分析，采用Duncans新复极差法测验差异显著性。

2 结果与分析

2.1 培养基质对菌落生长的影响 由表1可知，改良马丁氏培养基在培养10 d后的菌落直径最大，为5.70 cm，显著大于其他培养基的生长情况。培养初期，PPDA的菌落直径明显大于其他5种基质，第4天改良马丁培养基的直径开始迅速增大，从培养结果来看其菌落生长时紧密、肥厚，具有良好的营养条件，产孢量为5.13×108个/ml。因此，可以认为改良马丁氏培养基最适合Bb01菌株的生长。温度、湿度和紫外照射条件影响下的菌株生物学特性试验均采用该培养基进行培养。

2.2 温度对菌落生长情况的影响

由表2和图1可知，在

14～32 ℃条件下Bb01菌株均能生长，但不同温度下生长情

况各不相同。其中，26～28 ℃最适宜菌落生长，10 d后菌落直径分别达到6.14和6.10 cm，显著高于其他温度下的生长情况，菌落生长与温度具有良好的线性关系（R2=0.99）；14 ℃下菌落直径仅为1.86 cm，可见，相对低温不利于球孢白僵菌Bb01菌落的生长。

注：各个时间点柱上不同字母表示不同处理间在0.05水平差异显著。

图1 温度对球孢白僵菌Bb01菌落生长的影响

温度对白僵菌产孢量影响具有显著差异，菌株产孢量与菌落直径呈正相关，温度在28 ℃时产孢量最大，14 ℃低温既利于菌落的生长又不利于孢子的生产，而高温也不利于孢子的产生，球孢白僵菌Bb01的最佳产孢温度为26～28 ℃。

2.3 湿度对菌落生长情况的影响

由图2可知，菌落直径随着湿度的增加而增大，各湿度培养条件下随着时间的延长菌落直径呈现出逐渐增长的趋势；生长初期相对湿度为100%和85%时生长情况并无明显差异，但都高于同期的75%和65%处理组。当相对湿度为100%时菌落直径生长最快，生长10 d后菌落直径达到6.47 cm，而相对湿度为65%时菌落直径最小，生长10 d后菌落直径达到5.31 cm，仅为最高湿度处理的82.07%。

注：各个时间点柱上不同字母表示不同处理间在0.05水平差异显著。

图2 湿度对球孢白僵菌Bb01菌株生长的影响

由表3可知，相对湿度对菌落产孢量具有显著影响，相对湿度为100%时产孢量最大，且产孢量随着湿度的降低而降低，相对湿度为75%时10 d产孢量仅为湿度为100%的0.64倍。菌落生长与湿度具有良好的线性关系（R2=0.95）。

2.4 紫外线照射对菌落生长情况的影响

由图3可知，紫外线对球孢白僵菌Bb01菌株生长有明显抑制作用，随着照射时间的延长孢子基数变小。紫外照射120 min培养10 d后的菌落直径为2.20 cm，平均仅为对照的38.57%，长时间的紫外照射不利于球孢白僵菌孢子的活力，从而影响菌落的生长。紫外線照射处理长时间（75～120 min）内差异不显著，处理短时间内差异极显著。可见，紫外照射超过75 min以上对菌落生长影响不大，而短时紫外线照射对菌落生长影响较大。

注：各个时间点柱上不同字母表示不同处理间在0.05水平差异显著。

图3 紫外线照射对球孢白僵菌Bb01菌株生长的影响

由表4可知，球孢白僵菌Bb01菌株的产孢量随紫外线照射时间的延长而逐渐减少，可见紫外线照射对白僵菌的产孢量具有明显的抑制作用；对照组与紫外线照射处理15 min的产孢量无明显差异，与紫外线处理30 min以上产孢量差异极显著；紫外线照射时间与菌落生长均具有良好的线性关系（R2>0.90）。

2.5 青杨脊虎天牛成虫被球孢白僵菌侵染后外部特征

由图4可知，白僵菌对青杨脊虎天牛成虫具有一定侵染能力，

侵染初期，成虫活动状态与正常成虫并无区别，随着时间的延长感染成虫活动减缓、不活跃，只附在枝条或防虫网上，随后死亡。白僵菌对虫体侵染部位具有选择性，由于成虫外表坚固、组织紧密，白僵菌侵染部位主要为胸部节间处、翅膀下部和腹部体壁薄弱部位。

2.6 球孢白僵菌Bb01对青杨脊虎天牛成虫的侵染力 由表5可知，球孢白僵菌Bb01对青杨脊虎天牛成虫具有侵染能力，但侵染率不高，仅为16.67%。

表5 球孢白僵菌Bb01对青杨脊虎天牛成虫的侵染

处理处理数∥头侵染数∥头侵染率∥%

Bb0130516.67

CK1000

2.7 温度对球孢白僵菌Bb01菌株侵染力的影响

由表6可知，温度对菌株的侵染能力具有明显影响，各温度间对幼虫的累计死亡率各不相同，28 ℃处理第2天已有幼虫感染死亡，第4天20和26 ℃相继出现死亡情况，26 ℃处理第8天供试幼虫已全部死亡，直到第10天28 ℃处理幼虫也全部死亡，低温（14 ℃）下幼虫累计死亡率最小，试验期达到26.67%，而高温（32 ℃）下累计死亡率达到48.89%，低溫和高温均不利于白僵菌对青杨脊虎天牛幼虫的致病力。26 ℃ LT50用时最短，只有2.23 d，明显低于其他温度处理LT50，其次是28 ℃处理LT50为2.58 d。可见，26～28 ℃下球孢白僵菌Bb01菌株对青杨脊虎天牛幼虫的致病力最强。

2.8 湿度对球孢白僵菌Bb01菌株侵染力的影响

由表7可知，球孢白僵菌菌株对青杨脊虎天牛幼虫的侵染能力随着相对湿度的降低而降低，相对湿度100%处理时侵染力最大，第8天感染幼虫已全部死亡，LT50为2.57 d；相对湿度为90%时的侵染力仅次于100%处理，供试期内幼虫全部死亡，LT50为2.83 d。可见，球孢白僵菌Bb01菌株在相对湿度为100%～90%时对青杨脊虎天牛幼虫的侵染力最强。

2.9 传代方式对青杨脊虎天牛幼虫侵染力的影响

由表8可知，不同传代方式对青杨脊虎天牛幼虫的累计死亡率有明显影响，通过感染寄主所培养的菌株侵染力逐代增强，F1～F3代均表现出较强的致病力，其中F3代致病力最强在第8天时，供试幼虫已全部死亡，LT50值最小，仅为1.81 d，显著低于其他处理；通过培养基传代后的累计死亡率随着传代越多致病力越弱，LT50用时越长，S1～S3代虽然也表现出良好的致病力，但各代致病力明显低于F3代，S3代第4天累计死亡率仅为6.67%，仅为F3代的0.21倍，第10天S2和S3代累计死亡率分别为88.89%和84.45%，S3代LT50值最大，为2.64 d。

表

3 讨论

目前白僵菌的培养主要采用PDA、SDAY和Czapek培养基[5-6]，该研究采用6种不同基质的培养基，结果表明在改良马丁氏培养基上一定时间内的营养生长最快，且菌落生长厚实、紧密，培养条件最适宜，培养Bb01菌株应首选改良马丁氏培养基。相关研究表明，球孢白僵菌在营养生长时可不同程度地利用单糖、双糖和多糖等碳源和氮源，球孢白僵菌以蛋白质和白砂糖为培养基质时菌丝生长迅速，而菌丝对甘露醇和硫酸铵为培养基质时生长则较慢[7-8]。可见，不同成分的培养基质对菌丝的生长快慢具有决定作用，适宜的培养基质和培养环境会促进菌丝的快速生长。

相关研究表明，不同温度条件下白僵菌的营养生长和对害虫的致病性表现各不相同[8]，该试验结果表明，球孢白僵菌Bb01菌株最适的生长温度为26～28 ℃，同时也是最佳的产孢温度，温度过低和过高菌株均不能快速生长和有效产孢。徐艳聆等[9]研究表明14～32 ℃温度下白僵菌均能进行生长，并在26 ℃下生长最优，与该研究结果相一致。不同温度下对青杨脊虎天牛幼虫进行侵染结果表明，温度可直接影响球孢白僵菌Bb01菌株的致病力。当温度过低或过高时，菌株的致病力都不高，与不同温度下白僵菌生长量和孢子产量相吻合，温度为26 ℃时，白僵菌对幼虫侵染能力最强，且出现较早致死的现象，在8 d时累积死亡率达到100%，28 ℃处理也表现良好的侵染和致病效果。致死效果明显高于14、20和32 ℃处理效果。温度是菌落生长以及孢子生产和萌发的主要因素，而孢子侵染是白僵菌致病的主要途径[10]。球孢白僵菌可在较宽的温度范围内生长，谷祖敏等[11]研究表明22～26 ℃下球孢白僵菌对蚜虫有较强的侵染力，致死时间出现也最早，在26 ℃下5 d时的累计死亡率为100%，温度上升到30 ℃后死亡率随之下降，仅为90%，可见，高温直接影响孢子萌发从而影响致病力。温度降低能阻碍孢子的萌发，从而延长白僵菌的侵染和致死时间[12]。基于北方气候的特点，球孢白僵菌Bb01的施用理论上应选择春末夏初时的青杨脊虎天牛幼虫期为宜，但林间施用影响因素较多（如风、温湿度和光照等），对具体应用以及对青杨脊虎天牛蛹期的效果还有待进一步探索。

戴君惕认为湿度是能够直接影响球孢白僵菌菌丝生长的重要因素之一[13]，当相对湿度低于55%时菌丝基本不生长或生长很慢，随着湿度的升高菌丝的生长逐渐加快[14]。该研究中，随着相对湿度的逐渐降低菌株的生长量和产孢量逐渐降低，相对湿度为100%时菌落直径达到6.47 cm，孢子量为7.11×108个/ml，孢子在适宜的湿度条件下才能够萌发，研究菌株湿度的生物学特性可为生产上将球孢白僵菌制成可湿性粉剂等生物杀虫剂提供理论依据。湿度同样也是影响白僵菌致病力的重要因素之一，菌丝需要适宜的湿度才能形成分生孢子，而在虫体上的附着时间同样受到湿度的制约。该研究表明，湿度越高球孢白僵菌对青杨脊虎天牛幼虫的累计死亡率越高且用时越短，试验采用孢子浴法对试虫进行侵染，前期试验结果表明湿度越大产孢量也越大，所以湿度影响孢子的产出和萌发从而影响白僵菌的侵染力。孙鲁娟等[15]研究表明湿度在95%时侵染力最大，湿度降到70%以下时侵染力明显降低。室内试验能很好地控制湿度，但在林间施用应尽量选择空气湿度较大的阴天或雨天。

紫外线具有灭菌、抑菌的作用，实验室常用来杀菌准备工作。该研究采用不同紫外照射时间对球孢白僵菌Bb01生长和产孢量的影响，结果表明长时间的紫外照射能够明显抑制供试球孢白僵菌菌落的生长和产孢量，生长量和产孢量随着照射时间的延长而减少。在自然环境中，白僵菌极易受到紫外线的照射造成生产力的下降或变异，形成不稳定的性状，紫外线的照射主要会造成球孢白僵菌内DNA分子结构的损坏，由于胸腺嘧啶二聚体的产生会造成DNA复制受阻，细胞最终死亡[10]。为了防止紫外线的侵害，资料显示可在生产实践中加入抗坏血酸等化学保护剂来起到防护作用[15]。

白僵菌感染昆虫需要适宜的自然环境，如利于孢子萌发的温度、湿度和紫外照射等条件，白僵菌致病力的强弱同样受到当时立地环境的制约（温、湿、光、雨和风等）[16]，研究自然因素影响白僵菌对青杨脊虎天牛的致病力，对于野外实际防治青杨脊虎天牛具有理论指导意义。

完全变态昆虫发育经过受精卵-幼虫-蛹-成虫4个阶段。目前，采用病原真菌对有害昆蟲的防治多对其幼虫状态进行。该研究采用青杨脊虎天牛幼虫高毒力菌株球孢白僵菌Bb01对成虫进行侵染，结果表明菌株对成虫具有侵染力，但侵染效果只有16.67%，从死虫虫体上观察主要侵染部位为胸部的节间处、翅膀下部和腹部体壁薄弱部位。有研究表明球孢白僵菌Bb202-1菌株对松褐天牛成虫具有较高的杀虫活性，统计累计死亡率为88%，这种侵染差异结果主要是由白僵菌菌种的寄主专一性和种间差异所造成的[17]。而研究不同侵染部位，结果表明成虫足与腹部为主要感染部位，与该研究结果基本相同。李会平等[18]研究表明白僵菌对桑天牛虫卵不能进行侵染，对孵化的幼虫和成虫也无影响，对成虫具有一定的侵染力。由于青杨脊虎天牛独特的生物学特性，幼虫生长期基本都隐蔽在树干中，而只有羽化期才暴露在树干外进行繁殖，该时期对青杨脊虎天牛防治具有重要意义，如何采取无公害、高毒力的病原真菌对青杨脊虎天牛成虫进行防治有待进一步研究。

在生产实践中，菌种的继代培养常表现出产孢量降低、致病毒力减退等现象，如何对白僵菌进行有效的定向培养以及菌株复壮后的良好致病力成为菌种培养的一个方向。该试验选用球孢白僵菌培养基继代和虫体继代2种方式对青杨脊虎天牛幼虫侵染力进行比较，结果表明培养基继代后菌株对寄主侵染能力减弱，虫体继代后菌株对寄主侵染能力增强，与前人试验结果一致[19-20]。菌株继代培养后侵染能力的变化是受自身遗传物质控制的，随着传代的继续菌株内基因组DNA发生明显变化，传代越多产孢量越低[21]，培养环境的改变促使不同基因型核比例的改变，传统培养的方式会使以异核形式存在的白僵菌体内异核比例发生变化[22]。相关研究表明病原真菌的孢外蛋白酶和几丁质酶活性与侵染力有关[23-25]，培养基上继代培养后继代越多产酶水平越小，对害虫的致死中时越长；而虫体培养上继代越多产酶水平越高，致死中时越短，这可能是由于寄主表皮成分中含有能够诱导水解酶产生的特殊物质所致[18，26]。樊美珍等[27]认为增加动物性氮源比植物性氮源更能够促进白僵菌菌落格局的稳定性；动物性氮源可以有效增强菌落的产孢量和致病力[28]。白僵菌实际生产中要人为有效地控制菌株退化变异，选取优良菌株并进行培养改良，合理的营养基质成分可

以增强白僵菌菌株的生长和产孢量从而为高致病性做物质准备。建议在以后的实践中选用适合青杨脊虎天牛高毒力菌株的培养基中加入动物性氮源（如虫尸粉等）以保持菌株的生产活力，减小变异性。随着虫体传代的继续，多代后高侵染力依然能够保持有待进一步研究。

参考文献

[1] 蒲哲龙.昆虫病理学[M].8版.广州：广东科技出版社，1994：348.

[2] 杨敏芝，谭云峰，田志来.不同温、湿度和光照对白僵菌孢子活力的影响[J].吉林农业科学，2005，30（3）：60-61.

[3] 潘志平，李敦松，曾玲.环境因子对球孢白僵菌侵染桔小实蝇致病力的影响[J].环境昆虫学报，2008，30（1）：13-17.

[4] 王宝辉.高致病性绿僵菌菌株生物学特性及其对光肩星天牛幼虫组织病理变化的研究[D].保定：河北农业大学，2009.

[5] OLMERT I，KENNETH R G.Sensitivity of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana，Verticillium lecanii，and Verticillium spp.to fungicides and insecticides[J].Environ Entomol，1974，13：33-38.

[6] 刘宝生，谷希树，许静杨，等.白僵菌Bb08-12菌株生物学研究及其对美国白蛾的致病性[J].植物保护，2011，37（4）：146-149.

[7] 路国兵，王更先，韩景瑞，等.白僵菌菌株的分离鉴定及生物学特性研究[J].中国蚕业，2007，28（2）：13-15，32.

[8] 姚剑，黄大庆.球孢白僵菌脂肪酸、酯酶、脂肪酶以及与毒力的关系[J].中国生物防治，2005，21（3）：167-171.

[9] 徐艳聆，吕文彦，赵润洲，等.环境对球孢白僵菌生物学特性的影响[J].河南农业科学，2009（8）：95-97.

[10] 林华峰，樊美珍，李增智，等.不同温湿度下白僵菌对松毛虫的侵染致病效应[J].应用生态学报，1998，9（2）：195-200.

[11] 谷祖敏，纪明山，杨旭，等.球孢白僵菌对温室蚜虫的侵染生物学[J].华东昆虫学报，2006，15（4）：253-257.

[12] 武觐文.微生物杀虫剂的应用[M].北京：中国林业出版社，1990：256-273.

[13] 戴君惕.生物防治（三）[M].重庆：科学技术出版社重庆分社，1979：61-70.

[14] 国志峰，邵洪波，刘洪亮，等.球孢白僵菌BB11生物学特性研究[J].河北林果研究，2010，25（1）：57-61.

[15] 孙鲁娟，吴孔明，郭予元.不同温、湿度下白僵菌对棉铃虫幼虫的致病力[J].昆虫学报，2001，44（4）：501-506.

[16] 李农昌，樊美珍，李春如.白僵菌有关培养条件及其与毒力关系的研究[J].安徽农业大学学报，1996，23（3）：254-259.

[17] 应盛华，冯明光.球孢白僵菌分生孢子乳悬液的配方筛选[J].植物保护学报，2001，28（4）：345-351.

[18] 李会平，黄大庄，王志刚，等.不同基质传代白僵菌菌株孢外蛋白酶和几丁质酶产生水平与菌株对桑天牛幼虫毒力的关系[J].蚕业科学，2008，34（3）：521-524.

[19] 王四宝，黄勇平，张心团，等.松褐天牛成虫高毒力病原真菌筛选及林间感染试验[J].中国森林病虫，2004，23（6）：13-16.

[20] GUILLEBEAU L P.Risk-benefit analysis of pesticides：The US Environmental protection agency prespective[R].American entomologist，1994：173-179.

[21] 蔡国贵，林庆源，徐耀昌，等.白僵菌菌株退化与培养条件及其控制技术[J].福建林学院学报，2001，21（1）：76-79.

[22] ST LEGER R J.The role of extracellular chymoelastase in virulence of Metarhizium anisopliae for Manduca sexta[J].Journal of Invertebr Pathol，1988，52：285-293.

[23] 李會平，魏晓鹏，岳素红.桑天牛幼虫致病性白僵菌菌株退化的RAPD分析[J].蚕业科学，2013（2）：226-230.

[24] BIDOCHKA M J，KHACHATOURIANS G G.Purification and properties of an extracel lularprotease produced by Beauveria bassiana[J].Appl Environ Microbiol，1987，53：1679-1684.

[25] KUCERA M.Protease from fungus Metarhizium anisopliae toxic for Galleriam ellonella larvae[J].Journal of Invertebr Pathol，1980，35：304-310.

[26] 张志光，李建宗，欧笑兰，等.白僵菌生活史：（Ⅱ）异核体的形成和准性生殖的显微摄像观察[J].湖南师范大学自然科学学报，1981（2）：38-44.

[27] 樊美珍，李增智，唐晓庆.白僵菌退化及其控制[J].安徽农业大学学报，1996，23（3）：239-245.

[28] 胡景江，樊美珍.球孢白僵菌胞外蛋白酶与其毒力的关系[J].安徽农业大学学报，1996，23（3）：273-278.