miR—195表达调控对大肠癌细胞HT—29增殖和凋亡的影响及其机制探讨

吴巍芸

【摘要】 目的：探讨miR-195对大肠癌细胞HT-29增殖和凋亡的影响及可能的机制。方法：应用脂质体转染的方法，将miR-195 mimics转染入HT-29细胞，qRT-PCR检测转染后miR-195的表达，分别采用CCK-8法及流式细胞术检测细胞增殖和凋亡情况，qRT-PCR和Western blot检测转染后VEGFA mRNA和蛋白表达变化。结果：与NC组比较，miR-195 mimics转染组明显上调HT-29细胞miR-195的表达，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，下调VEGFA mRNA及蛋白表达，两组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：上调HT-29细胞的miR-195表达，可明显抑制细胞增殖、促进细胞凋亡，其机制可能与抑制其靶基因VEGFA表达相关。

【关键词】 微小RNA； 大肠癌； 血管内皮生长因子A； 增殖； 凋亡

【Abstract】 Objective： To investigate the effect of miR-195 on proliferation and apoptosis of colorectal cancer cell line HT-29 and its mechanism.Method： MiR-195 mimics was transfected into HT-29 cells by lipofectamine 2000. The miR-195 expression was measured by real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction （qRT-PCR），cell proliferation and apoptosis were respectively evaluated by CCK-8 assay and flow cytometry.VEGFA mRNA and protein were assessed by qRT-PCR and Western blot. Result：miR-195 mimics group was significantly increased miR-195 expression in HT-29 cells， inhibited cells proliferation and increased cells apoptosis and downregulation of mRNA VEGFA and protein expression， compared with the NC group，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：Overexpression of miR-195 in HT-29 cells may significantly suppress cells proliferation and induce cells apoptosis， probably via downregulating its target gene VEGFA expression.

【Key words】 MicroRNA； Colorectal cancer； VEGFA； Proliferation； Apoptosis

First-authors address：Affiliated Hospital of Guangdong Medical University，Zhanjiang 524001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.35.008

大肠癌（Colorectal cancer，CRC）是消化道常见的恶性肿瘤，发病率逐渐增高，并呈现出年轻化的趋势，严重威胁人类健康。癌基因和抑癌基因及信号通路的调控、表达失常，导致肿瘤的发生。近年来，越来越多的研究者开始关注微小RNA（microRNA，miR）在大肠癌发生发展中的作用。miRNAs是一类具有调控功能的非编码小分子RNA，通过与靶基因mRNA的特定位点部分和完全结合，导致mRNA的降解和/或阻碍其翻译[1]。研究发现，多种肿瘤存在异常的miRNAs表达谱[2-4]。其中，与正常大肠组织相比，miR-195在CRC组织中表达降低，但miR-195在CRC中的作用及其机制尚未完全明确[5-6]。本实验通过上调HT-29细胞的miR-195表达，初步探讨miR-195在CRC中的作用及机制，现将其具体报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 HT-29细胞株（中科院上海细胞库）于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养。人miR-195 模拟物（miR-195 mimics）、miR-195 mimics阴性对照（miR-195 mimics NC）购于广州锐博生物公司。转染前将HT-29细胞接种至6孔或12孔培养板，待细胞密度达60%～70%时进行转染。按miRNA mimics转染操作说明书混合Opti-MEM I培养基、miR-195 mimics或NC和lipofectamine 2000，将混合物加入铺好的6孔板中，放入37 ℃，5% CO2 的培养箱中培养6 h后，换为含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基继续培养至所需时间，收集细胞进行后续各项相关检测。实验分为两组，miR-195 mimics转染组：转染miR-195 mimics（终浓度100 nmol/L）；NC组：转染miR-195 mimics NC（终浓度100 nmol/L）。

1.2 实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）检测miR-195和VEGFA mRNA的表达 各组细胞转染后48 h，用TRIzol提取总RNA。按RT-PCR试剂盒（Takara）说明书进行miR-195和VEGFA的逆转录及PCR反应。分别以U6 snRNA和β-actin作为内参。应用罗氏LightCycler 480型PCR仪进行定量PCR分析。miR-195上游引物：5-TAGCAGCACAGAAATATTGGC-3；U6上游引物：5-CTCGCTTCGGCAGCACA-3；VEGFA上游引物：5-GAGCAGCGAAAGCGACAG-3，VEGFA下游引物：5-CTCCGAAGCGAGAACAGC-3；β-actin上游引物：5-GGCGGCAACACCATGTACCCT-3，β-actin下游引物：5-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3。反应结束后得到各样本miR-195和U6的循环数（Ct值），根据2-△Ct法计算miR-195的相对表达量，实验重复3次。

1.3 CCK-8法检测细胞增殖情况 HT-29细胞接种于96孔培养板，培养液体积200 μL，按上述分组转染，分别培养24、48、72 h后，每孔加入20 μL CCK-8（Dojindo公司），37 ℃继续培养2 h后于酶标仪上450 nm测定各孔吸光度（A450）。每个时间点设3个复孔，实验重复3次，根据时间和吸光度值绘制增殖曲线。

1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡情况 HT-29细胞接种于12孔培养板，分别转染miR-195 mimics和NC，培养48 h后收集细胞，PBS洗涤后依次分别加入Annexin V-FITC（碧云天公司）室温避光孵育10 min和碘化丙啶（PI）（碧云天公司）冰浴避光孵育30 min，上机检测，实验重复3次。

1.5 Western blot检测VEGFA蛋白的表达 转染72 h后，用Western及IP细胞裂解液提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度后，每个泳道上样40 μg蛋白样品，SDS-PAGE电泳分离，电转到PVDF膜上，5%牛奶封闭非特异位点，抗VEGFA抗体（Santa Cruz，1∶500）4 ℃孵育过夜。相应的二抗（1∶1000）室温孵育1 h，暗室显影，以Tubulin作为内参，以VEGFA蛋白与Tubulin蛋白条带的光密度比值计算VEGFA蛋白的相对含量，实验重复3次。

1.6 统计学处理 使用SPSS 19.0统计软件进行分析，计量资料采用（x±s）表示，比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组细胞miR-195表达比较 miR-195 mimics转染组的miR-195表达水平明显高于NC组，两组比较差异有统计学意义（P<0.05），见图1。

2.2 两组细胞增殖情况比较 CCK-8检测两组转染后细胞增殖情况，miR-195 mimics转染组于48、72 h增殖率较相应时间点的NC组明显下降，两组比较差异均有统计学意义（P<0.05），见图2。

2.3 两组细胞凋亡情况比较 转染miR-195 mimics至HT-29细胞，培养48 h后行流式细胞仪检测，miR-195 mimics转染组凋亡细胞较NC组明显增加，两组比较差异有统计学意义（P<0.05），见图3～4。

2.4 两组细胞的VEGFA表达 qRT-PCR和Western blot检测显示，miR-195 mimics转染组细胞VEGFA mRNA和蛋白的表达水平均较NC组明显降低，两组比较差异均有统计学意义（P<0.05），见图5。

3 讨论

目前已有研究证实miRNAs在大肠癌的诊断、预后判断及治疗效果预测中均发挥作用[7-9]。另外，miRNAs在癌前病变发展，对大肠癌细胞生物学行为的影响，新生血管生成中的作用等基础领域研究亦不断有新的进展[10-12]。研究发现，miR-195在多种肿瘤的发生发展有关。Guo等[13]报道与正常组织比较，miR-195在非小细胞肺癌组织和细胞株的表达明显下调，过表达miR-195能抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、转移和侵袭能力。miR-195通过作用于其靶基因脂肪酸合酶（FASN），抑制骨肉瘤细胞的转移和侵袭[14]。Yang等[15]亦报道，miR-195在乳腺癌细胞株和多药耐药的乳腺癌组织中均表达下降，上调miR-195的表达可以抑制乳腺癌细胞的活力，促进其凋亡，增加其对阿霉素治疗的敏感性。miR-195在肾上腺皮质癌患者的癌组织和血清中表达水平均降低，其血清低表达与较短的无复发生存和较短的总体生存有关，对于肾上腺皮质癌患者的预后预测有一定的价值[16]。多个研究显示，与正常组织比较，miR-195在CRC组织表达降低[5-6]。在本研究中，笔者转染miR-195 mimics使大肠癌细胞HT-29过表达miR-195，显示细胞增殖减少、凋亡增多，提示miR-195在CRC中发挥促凋亡的作用，与前面研究一致。

VEGFA是肿瘤血管生成的主要刺激因子之一，通过与其受体VEGFR-2作用，促进内皮细胞的增殖、侵袭、转移。VEGFA在CRC组织中表达上调，高表达的VEGFA与肿瘤进展及侵袭相关，是生存的一个重要预测因素[17]。使用VEGFA shRNA抑制RKO大肠癌细胞的VEGFA表达后，可使细胞周期停滞，减弱细胞增殖和侵袭能力，裸鼠种植瘤生长延缓[18]。Tai等[19]用siRNA抑制大肠癌Volo细胞的VEGFA表达后，亦可以抑制细胞增殖和转移，促进凋亡。于多种大肠癌细胞株，如SW620、HCT-116上使用RNAi技术干扰VEGFA表达也可得到类似的结果[20-21]。上述研究表明，VEGFA与大肠癌细胞的生物学特性相关。笔者通过电子信息学网站预测发现VEGFA是miR-195潜在靶基因之一。转染miR-195 mimics后，与阴性对照组相比，VEGFA mRNA和蛋白的表达水平均明显下调，说明在CRC中miR-195可能通过抑制VEGFA的表达，影响细胞的增殖和凋亡，可能是其参与肿瘤发生发展的机制之一。

综上所述，miR-195在CRC中发挥着类似抑癌基因的作用，随着研究的不断深入，阐明miRNA在肿瘤发生发展过程中的作用机制，以miRNA作为诊断和治疗的靶点，具有巨大的潜在价值。

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（收稿日期：2015-08-20） （本文编辑：周亚杰）