当归红芪超滤物对过氧化氢致内皮细胞凋亡中热休克蛋白70及内皮型一氧化氮合酶表达的影响

顾丽娟等

摘要：目的 探讨当归红芪超滤物对过氧化氢（H2O2）致内皮细胞凋亡中热休克蛋白70（HSP70）及内皮型一氧化氮合酶（eNOS）表达的影响。方法 H2O2诱导ECV-304人脐静脉内皮细胞凋亡制备模型，实验分为正常对照组、模型组、单纯药物组、药物干预组，并给予相应药物干预，流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞内Ca2+浓度，RT-PCR法检测HSP70、eNOS的基因表达，蛋白印迹法检测HSP70的蛋白表达，硝酸还原酶法及分光光度法检测一氧化氮（NO）的含量。结果 与正常对照组比较，模型组细胞凋亡率明显增加、细胞内Ca2+浓度明显上升（P<0.05），细胞HSP70基因和蛋白表达上调、eNOS基因表达下调及NO含量降低（P<0.05）；与模型组比较，药物干预组细胞凋亡率、细胞内Ca2+浓度明显降低（P<0.05），细胞HSP70基因和蛋白表达上调、eNOS基因表达上调及NO含量升高（P<0.05）。结论 当归红芪超滤物通过上调HSP70、eNOS的表达及NO含量，降低细胞内钙超载，发挥抗H2O2致ECV-304人脐静脉内皮细胞凋亡的作用。

关键词：当归红芪超滤物；过氧化氢；人脐静脉内皮细胞；细胞凋亡

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.015

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）04-0051-04

Effects of Ultra-filtration Extract from Angelicae Sinensis Radix and Hedysarum Polybotrys on Expressions of HSP70 and eNOS in H2O2-induced Endothelial Cell Apoptosis GU Li-juan， LIU Kai， SUN Shao-bo， LIU Guo-an， LI Ying-dong （Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China）

Abstract：Objective To investigate the effects of ultra-filtration extract from the mixture of Angelicae Sinensis Radix and Hedysarum Polybotrys （UFE-AH） on the expressions of HSP70 and eNOS in H2O2-induced endothelial cell apoptosis. Methods H2O2 induced ECV-304 cell apoptosis to prepare models. The experiment was divided into normal control group， model group， simple medicine group， medicine intervention group， and all treatment groups received relevant medicine for intervention. Flow cytometry （FCM） was used to detect apoptosis and concentration of intracellular Ca2+；RT-PCR was used to detect the mRNA expression of HSP70 and eNOS；Western blot was used to detect the expression of HSP70 protein；Nitrale reduetase and spectrophotometric method were employed to detect the content of NO. Results Compared with normal control group， cell apoptosis rate， concentration of intracellular Ca2+， and expression of HSP70 increased significantly in model group （P<0.05）；gene expression of eNOS mRNA and content of NO decreased （P<0.05）. Compared with model group， cell apoptosis rate and concentration of intracellular Ca2+ dropped in medicine intervention group （P<0.05）；expressions of HSP70， eNOS mRNA and content of NO increased （P<0.05）. Conclusion UFE-AH can confront H2O2-induced cell apoptosis H2O2 of ECV-304 human umbilical vein endothelial by increasing the expressions of HSP70 and eNOS and content of NO， and reducing the intracellular calcium overload.

Key words：UFE-AH；H2O2；human umbilical vein endothelial cell；cell apoptosis

基金項目：甘肃省自然科学研究基金计划（1010RJZA174）

通讯作者：刘凯，E-mail：xubo_l@163.com

内皮细胞损伤是常见心脑血管疾病的始发因素，氧化损伤是主要原因及机制之一，防治内皮细胞损伤可使心脑血管病患者获益。研究表明，多种中药具有抗氧化损伤作用，提示其对内皮细胞的氧化损伤具有拮抗作用[1]。本课题组前期研究表明，益气补血中药当归、红芪（1∶5）配伍后经超滤技术提取的有效组分具有抗氧化、改善心肌缺血等功效[2-5]。本实验旨在研究0～10万分子量范围的当归红芪超滤物对过氧化氢（H2O2）致ECV-304人脐静脉内皮细胞损伤后细胞凋亡率、钙超载、热休克蛋白70（HSP70）及内皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因表达的影响，为其在临床防治心脑血管疾病的推广应用提供实验依据。

1 实验材料

1.1 药物

当归采自甘肃岷县，红芪采自甘肃宕昌，經甘肃中医学院生药学教研室鉴定为伞形科当归属Angelica Sinensis （Oliv.）Diels的根和豆科红花岩黄芪属植物多序黄芪Hedysarum Polybotrys Hand.- Mazz.的干燥根茎。按比例配伍，经水煎，微滤，超滤，喷雾干燥等工艺制备，参照文献[6]，由甘肃中医学院、甘肃膜科学技术研究院及兰州佛慈制药股份有限公司联合制备药物。高效液相色谱法检测指纹图谱进行质量控制[样品用50%甲醇溶解，微波助溶， Inertsil ODS-SP G8色谱柱（5 μm，4.6 mm×150 mm），检测波长275 nm，甲醇-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱（0～20 min，3∶97；20～40 min，20∶80；40～50 min， 60∶40；50～60 min，90∶10）]。

1.2 细胞

人脐静脉内皮细胞系ECV-304细胞，购自中国典型培养物保藏中心（编号GDC023）。

1.3 主要试剂与仪器

DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶：GIBCO公司；过氧化氢：天津市富宇精细化工有限公司，批号20130331；总RNA抽提试剂盒、RT-PCR反应试剂盒：生工生物工程（上海）有限公司；Maker：1000 bp DNA ladder，大连宝生物有限公司；HSP70、eNOS基因引物：南京金斯瑞生物科技有限公司合成；Fluo-3试剂盒：美国Sigma公司；AnnexinⅤ/PI细胞凋亡试剂盒：Invitrogen公司；兔抗鼠Hsp70、β-actin多克隆抗体：Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG：武汉博士德生物工程有限公司；一氧化氮（NO）试剂盒：南京建成生物工程研究所。XL型流式细胞仪：美国Coulter公司；PE2400型PCR扩增仪：美国PE公司；BTS-20.M型凝胶成像分析系统：Uvitec公司产品；DYCP31A型电泳槽、HV-3000型电泳仪：北京市六一仪器厂。

2 实验方法

2.1 造模与分组

参照文献[7]方法。将ECV-304人脐静脉内皮细胞按1.0×l05个/mL密度接种，配制含10%胎牛血清，青霉素、链霉素各100 U/mL的低糖DMEM完全培养基，37 ℃、5%CO2培养箱中常规培养，每隔1.5 d换液。200 μmol/L H2O2诱导心肌细胞凋亡。实验分为正常对照组（完全培养基中加与各组等量的生理盐水常规培养细胞32 h后换液，完全培养基中加与各组等量的生理盐水常规培养细胞6 h）、单纯药物组（完全培养基中加终浓度6 g/L的当归红芪超滤物培养32 h后换液，完全培养基中加终浓度6 g/L当归红芪超滤物培养6 h）、模型组（完全培养基中加与各组等量的生理盐水常规培养细胞32 h后换液，完全培养基中加终浓度200 μmol/L H2O2培养6 h）、药物干预组（完全培养基中加终浓度6 g/L当归红芪超滤物培养32 h后换液，完全培养基中加终浓度200 μmol/L H2O2培养6 h）。

2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡

0.25%胰酶消化收集各组细胞，预冷PBS洗涤细胞，在染色缓冲液中5×105/mL重悬细胞，吸取100 μL细胞（1×105）至试管中，加入5 μL的荧光标记的Annexin V试剂和3 μL碘化丙啶，混匀后避光室温孵育15 min，孵育后加入400 μL染色缓冲液，流式细胞仪检测。

2.3 流式细胞仪检测细胞内Ca2+含量

常规消化、离心、收集各组细胞，用冷PBS洗涤细胞，加2 mL细胞孵育液、1 mmol/L Fluo3-AM 8 μL， 30 ℃水浴孵育20 min，洗涤细胞2次后悬浮细胞，于激发波长506 nm、发射波长526 nm，测定荧光值F。加入100 μL含20%Triton X-100和20 mmol/L CaCl2溶液100 μL，测得Fmax，再加pH 7.0 200 mmol/L EGTA 100 μL，测得Fmin。[Ca2+]=Kd[（F-Fmin）/（Fmax-F）]，其中Kd=0.40 μmmol/L。

2.4 RT-PCR法检测热休克蛋白70及内皮型一氧化氮合酶基因的表达

常规消化、离心、收集各组细胞，按试剂盒说明提取总RNA。根据文献选用特异性引物[7-8]。HSP70上游引物：5'-AAGGTGGAGATCATCGCCAA-3'，HSP70下游引物：5'-GCGATCTCCTTCTTCATCTTGGT-3'；eNOS上游引物：5'-CAAGTTCCCTCGTGTGAAGAACTG-3'，eNOS下游引物：5'-GAGCTGTAGTACTGGTTGATGAAGTC-3'；β-actin上游引物：5'-GTGGACATCCGCAAAGAC-3'，β-actin下游引物：5'-AAAGGGTGTAACGCAACTAA-3'。产物长度：HSP70 300 bp，eNOS 214 bp，β-actin 302 bp。根据RT-PCR反应试剂盒说明及参考文献设定反应条件进行反转录与PCR扩增。各组取10 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像成像系统分析各条带的光密度，以目的基因条带与内参基因（β-actin）条带的光密度比值计算相对表达量。

2.5 蛋白印迹法检测热休克蛋白70的蛋白表达

收集各组细胞，PBS洗涤，裂解细胞提取总蛋白，考马斯亮蓝法绘制标准曲线，测定蛋白浓度。每组各取50 μL蛋白，经SDS PAGE电泳后转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，分别加HSP70，β-actin抗体4 ℃孵育过夜，加辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG于37 ℃孵育1 h，加ECL发光试剂孵育1 min，暗室将膜在感光胶片上曝光，加显影液，定影液洗像。用Alpha Imager 2200图像分析系统进行灰度扫描，计算HSP70与β-actin灰度比值。

2.6 一氧化氮含量测定

按试剂盒说明书操作，应用硝酸还原酶法及分光光度法测定各组细胞培养上清液中NO含量。

3 统计学方法

采用SPSS11.5统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间计量资料采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 当归红芪超滤物对过氧化氢致内皮细胞早期凋亡的影响

D1象限代表细胞收集过程中机械损伤细胞碎片；D2象限代表晚期凋亡与坏死细胞；D3象限代表正常细胞；D4象限代表早期凋亡细胞。与正常对照组比较，模型组早期凋亡细胞百分率均明显上升、正常细胞百分率明显下降（P<0.05），单纯药物组早期凋亡细胞百分率有下降趋势、正常细胞百分率有上升趋势；与模型组比较，单纯药物组、药物干预组正常细胞百分率明显上升、早期凋亡细胞百分率明显下降（P<0.05）。结果见表1。

4.2 当归红芪超滤物对过氧化氢致内皮细胞钙超载的影响

与正常对照组比较，模型组细胞内Ca2+浓度明显上升（P<0.05）；与模型组比较，药物干预组细胞内Ca2+浓度明显下降（P<0.05）。结果见表2。

4.3 当归红芪超滤物对过氧化氢致损伤内皮细胞热休克蛋白70、内皮型一氧化氮合酶基因表达的影响

与正常对照组比较，模型组细胞HSP70 mRNA表达明显上升、eNOS mRNA表达明显下降，单纯药物组细胞eNOS mRNA表达有增高的趋势；与模型组比较，药物干预组细胞HSP70、eNOS mRNA表达明显上升（P<0.05）。结果见表3、图1。

4.4 当归红芪超滤物对过氧化氢致损伤内皮细胞热休克蛋白70蛋白表达的影响

与正常对照组比较，模型组细胞内HSP70蛋白表达明显上升（P<0.05）；与模型组比较，药物干预组细胞内HSP70表达上升（P<0.05）。结果见表4、图2。

4.5 当归红芪超滤物对过氧化氢致损伤内皮细胞一氧化氮含量的影响

与正常对照组比较，模型组NO含量明显下降，单纯药物组NO含量明显升高（P<0.05）；与模型组比较，单纯药物组、药物干预组NO含量明显升高（P<0.05）。结果见表5。

5 讨论

H2O2损伤细胞是经典的细胞学氧化损伤模型。H2O2作用于人脐静脉内皮细胞，产生的活性氧引起细胞脂质过氧化，膜转运功能异常，离子转运异常，细胞内钙超载，异常升高的Ca2+造成脂质过氧化，激活磷酸酶、蛋白酶及细胞骨架的改变，形成恶性循环，诱导细胞凋亡。热休克蛋白又称应激蛋白，HSP70通過分子伴侣功能发挥细胞与脏器保护作用。作为分子伴侣，HSP70具有明显减轻细胞损伤的作用，也可通过多种途径抑制凋亡的发生，对许多细胞内应激起保护作用。HSP70可通过抑制氧自由基的关键酶的产生，减少细胞损伤后自由基的产生；增加内源性过氧化酶水平，清除氧自由基；抑制细胞Ca2+内流，拮抗活性氧介导的钙超载引起的细胞损伤与凋亡。eNOS是内皮功能完整性标志酶之一，eNOS是钙依赖蛋白酶，通过催化精氨酸合成内皮源性舒张因子NO，维持血管内皮的正常生理功能。

本实验结果显示，H2O2可以造成离体培养的人脐静脉内皮细胞的凋亡，在凋亡过程中细胞内出现了钙超载，HSP70作为一种保护性蛋白其表达明显升高，H2O2损伤影响了内皮细胞的正常生理功能，eNOS基因表达水平下降，NO合成与分泌明显降低。当归红芪超滤物对H2O2引起的内皮细胞损伤有拮抗作用，具有抗H2O2致人脐静脉内皮细胞凋亡的作用，具有减轻细胞内钙超载，促进HSP70基因的表达、维持正常内皮细胞功能、上调eNOS表达、维持NO合成与分泌的作用。当归红芪超滤物单用对人脐静脉内皮细胞具有减少自然凋亡率、eNOS基因表达、促进NO合成与分泌明显的趋势。本研究结果提示，当归红芪超滤物具有抗内皮细胞氧化损伤、维持血管内皮功能稳态的作用，对预防及治疗心脑血管疾病具有积极意义。

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（收稿日期：2014-06-18；编辑：华强）