香蕉MaPIP2—2基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

侯晓婉　胡伟　颜彦　徐碧玉　金志强

摘 要 水通道蛋白（AQPs）是细胞间和细胞内水分运输的主要通道， 对于植物细胞的水分稳态和胁迫响应具有重要作用。本研究从香蕉中克隆了一个水通道蛋白基因MaPIP2-2。序列分析结果表明，该基因的开放阅读框（ORF）为846 bp，编码281个氨基酸。多序列比对和进化树分析结果表明，该基因编码的蛋白与其它植物中水通道蛋白具有较高的一致性，并且与拟南芥AtPIP2-2和AtPIP2-3的亲缘关系最近。亚细胞定位表明该基因定位在细胞膜上。实时荧光定量PCR分析结果表明，该基因能够在转录水平响应甘露醇、低温、NaCl胁迫和ABA信号。这些结果表明MaPIP2-2可能参与了非生物逆境胁迫应答，为进一步研究MaPIP2-2基因的功能鉴定了基础。

关键词 水通道蛋白；PIP；香蕉；克隆；亚细胞定位；荧光定量PCR

中国分类号 Q344.13 文献标识码 A

Abstract Water channel protein，（Aquaporins， AQPs）， which was the main water transport corridor， plays a major role in maintaining water steady state and the stress response. In the present study， a AQP gene designated MaPIP2-2 from banana was isolated. MaPIP2-2 ORF was 846 bp， encoding 281 amino acids. Comparison of amino acid sequences and phylogenetic analysis indicated that MaPIP2-2 was closely related with AtPIP2-2 and AtPIP2-3. Subcellular localization assays showed that the MaPIP2-2 protein was present in the plasma membrane. Real-time quantitative polymerase chain reaction（QPCR）assay revealed that MaPIP2-2 participated in the response of abiotic stresses at transcriptional level. These results indicated that MaPIP2-2 might be involved in abiotic stress responses. The study would lay a foundation for further investigating the function of MaPIP2-2.

Key words Aquaporins； PIP； Banana； Cloning； Subcellular localization； Quantitative RT-PCR

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.07.014

水是生物体的主要组成部分，对生命至关重要。植物体的生长很大程度上取决于植物对水分的吸收和运输，然而高盐、干旱、低温等环境胁迫导致植物体内水分的缺失，严重影响植物的生长发育[1]。香蕉作为世界第四大粮食作物，因其特有的浅根和需要大量水份维持的永久性绿色树冠，对任何条件引起的水份缺失异常敏感[2]，因此研究香蕉如何响应非生物胁迫显得尤为重要。

水分在植物体不同组织之间的运输主要是通过质外体和共质体途径[3]。水通道蛋白AQPs（Aquaporin， AQP）参与了水分共质体途径的运输，负责水分的快速跨膜转运，扮演着“细胞的水管工”，介导植物种子萌发、细胞伸长、气孔运动、韧皮部的装卸及逆境应答等多个生理过程[4-5]。AQP通过快速改变植物膜的通透性以应对外界环境的变化，在植物对逆境胁迫的应答中发挥着重要作用[6-7]。已有的报道表明，来自于水稻、小麦、拟南芥等多个物种的AQP家族基因能够在转录水平响应非生物胁迫及相关信号分子，但香蕉中AQP家族基因功能的研究还非常有限。

水通道蛋白（AQP）属于膜内嵌蛋白MIP（a class of major intrinsic proteins，MIP）的一个大的亚家族，是由四聚体组成的沙漏状结构。由5个短环（A-E 环）连接的6个跨膜a-螺旋组成，其中B、D 环各有一段高度保守的天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸（Asn-Pro-Ala，NPA）元件，它们与其他跨膜区域共同形成通道[3，8-9]。根据结构和定位，AQP被分为4类，分别为质膜内嵌蛋白（the plasma membrane intrinsic proteins，PIPs）、液泡膜内嵌蛋白（the tonoplast intrinsic proteins，TIPs）、小分子碱性膜内嵌蛋白（the recently characterized small basic intrinsic proteins，SIPs）和类NOD 26膜内嵌蛋白（the NOD-26-like intrinsic proteins，NIPs）[10-13]。

本研究从香蕉中克隆了一个MaPIP2-2基因，并对其在逆境胁迫以及ABA处理下的表达模式进行了研究。研究结果表明，克隆得到的MaPIP2-2基因编码的蛋白具有AQP家族蛋白的基本特征；MaPIP2-2基因的表达能够响应非生物逆境胁迫及ABA信号。本研究的结果为进一步研究MaPIP2-2基因的功能奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 生长正常的五叶一心巴西蕉（Musa AAA Cavendish cv. Brazilian）幼苗取自中国热带农业科学院儋州组培中心。

1.1.2 主要试剂 PEG6000、NaCl、ABA、AS、MES等生化试剂购自上海生工生物工程有限公司；氯仿、异戊醇等各种分析纯试剂购自广州化学试剂公司；限制性内切酶、反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒购自TaKaRa公司；T4连接酶购自BioLab试剂公司，胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自OMEGA试剂生物公司，PCR试剂购自康为试剂生物公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的获得 从香蕉A基因组测序数据库中得到一个AQP家族基因，根据ORF序列设计一对引物（5'- CATGCCATGGCGATGTCGAAGGA

GGTCAGTGA-3'；5'-GGACTAGTGTTGGTGGGGTT

GCTCCG-3'）扩增MaPIP2-2 cDNA全长序列。PCR扩增程序为：变性，94 ℃，40 s；退火，55 ℃，40 s；延伸，72 ℃，1 min 30 s；共35个循环。扩增体系为20 μL体系：Mix，10 μL；Primer F，1 μL；Primer R，1 μL；cDNA，1 μL；ddH2O，7 μL。PCR扩增产物回收、连接、转化后，挑取单克隆在LB液体培养基中培养并进行PCR鉴定。对已鉴定的阳性克隆进行测序分析。

1.2.2 生物信息学分析 在NCBI中利用BLASTX进行序列同源性分析，从中选取相似性较高的同源序列用DNAMAN软件进行氨基酸序列的多重比对。另外，为了确认与其他物种中同源基因的亲缘关系，利用MEGA软件对拟南芥AQP基因家族和克隆出的MaPIP2-2基因一起构建系统发育树。

1.2.3 MaPIP2-2亚细胞定位分析 （1）瞬时表达载体构建。根据目的基因MaPIP2-2序列设计带有酶切位点NcoⅡ/SpeⅠ和不含终止子的载体引物：5'-CATGCCATGGCGATGTCGAAGGAGGTCAGTGA-3'；5'-GGACTAGTGTTGGTGGGGTTGCTCCG-3'。扩增产物回收后连接到克隆载体pMD18-T上，获得重组质粒，阳性克隆测序正确后，用NcoⅡ/SpeⅠ进行双酶切并回收目的片段。同时，利用NcoⅡ/SpeⅠ双酶切并回收的pCAMBIA1302载体大片段。利用T4连接酶将目的片段和载体片段进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α后，挑取单克隆扩大培养，经PCR和质粒双酶切验证后，进行测序分析，从而成功构建植物表达载体pCAMBIA1302-MaPIP2-2-GFP。将测序正确的阳性克隆的质粒以及pCAMBIA1302空载体质粒分别转入农杆菌LBA4404中。

（2）农杆菌法介导的亚细胞定位。利用农杆菌介导的瞬时转化法将pCAMBIA1302-MaPIP2-2-GFP和空载体（pCAMBIA1302-GFP）导入洋葱表皮细胞中[14]。随后将洋葱表皮放在铺有滤纸的MS固体培养基上，25 ℃暗培养16～24 h，然后制作装片，通过FluoViewTM FV1000激光扫描共聚焦显微镜观察荧光信号。

1.2.4 基因表达分析 将生长一致的五叶一心巴西蕉分成4组，将第1组用300 mmol甘露醇（Mannitol）处理7、10、15、17 d；第2组用300 mmol NaCl处理8、12、24、32 d；第3组在8 ℃冷害下培养10、22、47 h，之后将处理47 h的幼苗置于人工气候培养箱中恢复一周；第4组用100 μmol的ABA处理2、6、12、24 h。参照淦国英[15]改良的CTAB法提取每个处理时间点的香蕉叶片RNA，用自带DNA消化酶的cDNA反转录试剂盒反转成cDNA。以反转录的cDNA第一链为模板，用TaRaKa公司的实时荧光定量PCR试剂盒中的SYBR Green、ROX染料进行实时荧光定量PCR扩增，反应在吉泰生物科技有限公司Mx3005P荧光定量PCR仪上进行。以香蕉RPS2基因为内参。定量方法为2-△△CT法：ΔΔCT=（CT， Target-CT， Actin）Timex-（CT， Target-CT， Actin）Time0[16]。设计引物参考TaKaRa实时荧光定量标准说明书。为了保证引物的特异性，引物设计在非翻译区，PCR产物的长度维持在300 bp以内，并进行了测序分析。设计引物完成后（MaPIP2-2-3F：5'-TCGGCTTTGCTGTGTTCA-3'；MaPIP2-6-3R：5'-TCAGTTGGTGGGGTTGCT-3'；MuRPS2F：5'-TAGGGATTCCGACGATTTGTTT-3'；MuRPS2 R：5'-TAGCGTCATCATTGGCTGGGA-3'），送上海生工生物工程有限公司合成。荧光定量PCR的反应程序如下：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，50 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，循环40次。

2 结果与分析

2.1 MaPIP2-2基因的克隆及生物信息学分析

根据香蕉A基因组测序数据库中的信息，从香蕉栽培品种巴西蕉中克隆到一个AQP家族基因，其ORF为846 bp，编码281个氨基酸。从GenBank中选择拟南芥的全部35个AQP家族成员及笔者所克隆的香蕉AQP基因的氨基酸序列，利用MEGA5.0软件构建系统发育树（图1），结果表明本研究克隆得到的AQP基因所编码的氨基酸序列与AtPIP2-2和AtPIP2-3具有较近的亲缘关系，蛋白序列比对表明它们之间的相似度分别为74.39%和73.68%，故将该基因命名为MaPIP2-2。BLASTX分析表明，MaPIP2-2编码的氨基酸序列与姜花的HcPIP2（AEF32110.1）、海枣PdPIP2-6（XP_008809438.1）、桑树MnPIP2-7（XP010107654.1）、可可TcPIP2-8（XP007041804.1）的氨基酸序列具有较高的一致性，分别为93%、89%、88%和88%（图2）。多序列比对分析表明，MaPIP2-2具有PIP亚家族蛋白的基本特征，其氨基酸序列有6个保守的跨膜螺旋，5个短环，1个高度保守的氨基酸序列‘HINPAVTFG和2个‘NPA元件。这些结果表明本研究克隆的MaPIP2-2为香蕉PIP亚家族的成员（图2）。

2.2 MaPIP2-2蛋白的亚细胞定位分析

以构建的MaPIP2-2基因的植物表达载体pCAMBIA1302-MaPIP2-2-GFP，利用农杆菌介导的瞬时转化法将其和空载体（pCAMBIA1302-GFP）导入洋葱表皮细胞中，对MaPIP2-2蛋白在植物亚细胞结构中的分布进行研究。激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白信号在细胞内的分布，结果显示35S∶GFP绿色荧光蛋白在洋葱表皮细胞的细胞质、细胞核和细胞膜上均有表达，35S∶MaPIP2-2-GFP在洋葱表皮细胞的细胞膜上表达（图3）。这一结果表明MaPIP2-2蛋白定位在细胞膜上。

2.3 MaPIP2-2基因在非生物逆境胁迫及ABA处理下的表达分析

利用实时荧光定量PCR对MaPIP2-2基因在NaCl、甘露醇（Mannitol）、低温、ABA处理下的表达模式分析的结果表明，在NaCl处理下，与对照相比较，MaPIP2-2基因的表达在处理8～24 d显著被诱导了1.3～2.3倍（图4-A）。在甘露醇处理下，与对照相比较，MaPIP2-2基因的表达在处理7～17 d被抑制（图4-B）。在低温处理下，与对照相比较，MaPIP2-2基因的表达在处理10 h被显著诱导了2倍，达到最大值2.076 68，随后逐渐下降（图4-C）。在ABA处理下，MaPIP2-2基因的表达在处理2 h时被显著诱导，随后在处理6 h时却又下降到1.127 14，而在处理6～24 h时逐渐升高并达到最大值3.759 61，与对照相比较，ABA处理下，MaPIP2-2基因整体呈显著诱导趋势（图4-D）。

3 讨论与结论

近年来水通道蛋白（AQP）家族基因的功能已经广泛被报道，但是关于香蕉中水通道蛋白（AQP）家族基因的研究非常有限。本研究从香蕉中克隆了一个AQP基因（MaPIP2-2），该基因编码的氨基酸序列具有AQP家族蛋白的基本特征，与其它物种中AQP家族成员具有较高的一致性，与拟南芥AtPIP2-2和AtPIP2-3具有较近的进化关系。亚细胞定位分析表明，MaPIP2-2定位于细胞膜上，与MaPIP1；1和TaAQP7等AQP基因的细胞定位结果一致[1，18]，进一步说明了MaPIP2-2具有PIP蛋白的特征。因此，可以推测本研究所克隆的基因是AQP家族中PIP亚类中的一个成员。

大量的研究表明AQP家族基因能够调节植物体内水分的平衡，保持植物细胞水分稳态，并且能够快速响应环境胁迫，在植物对逆境胁迫的应答中发挥着重要作用。因此，本研究运用实时荧光定量PCR的方法研究了香蕉MaPIP2-2基因在转录水平对甘露醇、低温、高盐和ABA信号的应答。结果表明，在高盐和ABA处理下，MaPIP2-2基因的表达趋势基本一致，均被显著诱导。这一结果与在高盐处理下香蕉MaPIP1；1、小麦TaNIP和TaAQP8基因的表达趋势一致，同时小麦TaNIP、TaAQP8被证实能够增强转基因植株对干旱、高盐和低温胁迫的耐受性[1，18-19]；而在ABA处理下的表达趋势与水稻OsPIP1-1、OsPIP1-2、OsPIP2-1、OsPIP2-3、OsPIP2-4和OsPIP2-5的一致，同时水稻OsPIP1-1被证明能够显著提高植物对高盐和干旱的耐受性[20]。这些结果表明一些水通道蛋白家族成员在高盐和ABA处理下发挥着正向调控作用。因此，MaPIP2-2基因可能在植物响应高盐胁迫和ABA信号过程中起着重要作用。

在甘露醇处理下，MaPIP2-2基因的表达被显著抑制。这一结果与Guo等[20]报道的PEG6000处理下水稻叶片中OsPIP2-4和根系中OsPIP1-2，OsPIP1-3，OsPIP2-2的表达趋势一致。在低温处理下，MaPIP2-2基因的表达被早期诱导，表明巴西蕉对低温胁迫的响应较为敏感，在处理初期就能达到最大值。这一结果与Huang等[21]研究的TaAQP7在低温胁迫下的研究结果一致，而TaAQP7在烟草中过表达增强了转基因植株对干旱、高盐和低温胁迫的耐受性[17]。因此，MaPIP2-2基因可能参与了植物对低温和甘露醇的耐受过程。

综上所述，MaPIP2-2基因编码的蛋白具备PIP亚家族蛋白的基本结构特征，是AQP家族中PIP亚类的一个成员。MaPIP2-2基因能够在转录水平响应甘露醇、低温、NaCl和ABA信号，这些结果表明MaPIP2-2能够参与非生物逆境胁迫应答，并在其中发挥重要作用。为进一步研究MaPIP2-2基因的功能奠定了基础。

参考文献

[1] Xu Y， Hu W， Liu J H， et al. A banana aquaporin gene， MaPIP1；1， is involved in tolerance to drought and salt stresses[J]. BMC Plant Biology， 2014， 14（1）： 59.

[2] Van Asten P， Fermont A， Taulya G. Drought is a major yield loss factor for rainfed East African highland banana[J]. Agric Water Manage， 2011， 98（4）： 541-552.

[3] Sreedharan S， Upendra K S S， Ganpathi T. Transgenic banana plants overexpressing a native plasma membrane aquaporin MusaPIP1；2 display high tolerance levels to different abiotic stresses[J]. Plant Biotechnology Journal， 2013， 11（3）： 948.

[4] 刘迪秋， 王继磊， 葛 锋， 等. 植物水通道蛋白生理功能的研究进展[J]. 生物学杂志， 2009， 26（5）： 63-66.

[5] 朱美君， 康 蕴， 陈 珈， 等. 植物水通道蛋白及其活性调节[J]. 植物学通报， 1999， 16（1）： 44-50.

[6] Vera-Estrella R， Barkla B， Bohnert H J， et al. Novel regulation of aquaporins during osmotic stress[J]. Plant Physiol， 2004， 135（4）： 2 318-2 329.

[7] Maurel C， Verdoucq L， Luu D.-T， et al. Plant aquaporins： membrane channels with multiple integrated functions[J]. Annu Rev Plant Biol， 2008（59）： 595-624.

[8] 李 军， 乙 引 植物水通道蛋白的运输和调节[J]. 植物生理学通讯， 2010， 46（5）： 493-498.

[9] Chaumont F， Barrieu F， Wojcik E， et al. Aquaporins constitute a large and highly divergent protein family in maize[J]. Plant Physiology， 2001（12）： 1 206-1 215.

[10] Johansson U， Karlsson M， Johansson I， et al. The complete set of genes encoding major intrinsic proteins in Arabidopsis provides a framework for a new nomenclature for major intrinsic proteins in plants[J]. Plant Physiology， 2001， 126（4）： 1 358-1 369.

[11] Johansson U， Karlsson M， Johansson I， et al. The role of aquaporins in cellular and whole plant water balance[J]. BBA-Biomembranes， 2000， 1 465（1-2）： 324-342.

[12] Maurel C. Aquaporins and water permeability of plant membranes[J]. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology， 1997（48）： 399-429.

[13] Rivers R L， Dean R M， Chandy G， et al. Functional analysis of nodulin 26， an aquaporin in soybean root nodule symbiosomes[J]. Journal of Biological Chemistry， 1997， 272（26）： 16 256-16 261.

[14] 邢文婷. 香蕉MaMYB基因克隆及抗旱功能研究[D]. 海口： 海南大学， 2014.

[15] 淦国英， 漆艳香， 蒲金基， 等. 改良CTAB 法提取高质量香蕉叶片总RNA[J]. 广东农业科学， 2009（7）： 192-195.

[16] Liva K J， Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCt method[J]. Method， 2001， 25（4）： 402-408.

[17] Zhou S Y， Hu W， Deng X M， et al. Overexpression of the wheat aquaporin gene， TaAQP7， enhances drought tolerance in transgenic tobacco[J]. Plos One， 2012（7）： 1-14.

[18] Gao Z X， He X L， Zhao B C， et al. Overexpressing a putative aquaporin gene from wheat， TaNIP， enhances salt tolerance in transgenic Arabidopsis[J]. Plant Cell Physiol， 2010， 51（5）： 767-775.

[19] Hu W， Yuan Q Q， Wang Y， et al. Overexpression of a wheat aquaporin gene， TaAQP8， enhances salt stress tolerance in transgenic tobacco[J]. Plant Cell Physiol， 2012， 53（12）： 2 127-2 141.

[20] Guo L， Wang Z Y， Lin H， et al. Expression and functional analysis of the rice plasma-membrane intrinsic protein gene family[J]. Cell Research， 2006， 16（3）： 277-286.

[21] Huang C， Zhou S， Hu W， et al The wheat aquaporin gene TaAQP7 confers tolerance to cold stress in transgenic tobacco[J]. Zeitschrift Für Naturforschung Section C-A Journal of Biosciences， 2014， 69（3-4）： 142-148.