法医DNA常量检材Chelex—100提取法探究

吴俊蓉 李宗壮

【摘要】目的：对Chelex-100提取法在常量检材DNA提取中的应用情况进行研究。方法：选取20份送检的常量检材，包括烟蒂、染血棉签、纱条、FTA卡片等检材，采用Chelex-100提取法对唾液、血痕进行检测，并对检测情况进行整理分析。结果：1组DAN浓度为2.31±0.2ng/μl；2组DNA浓度为2.28±0.4ng/μl；3组DNA浓度为2.49±0.3ng/μl，不同浓度的Chelex-100检测的DNA浓度比较无明显差异，且均能够达到检验目的。结论：低浓度Chelex-100在常量检材DNA提取中即可取得良好的效果，能够准确的提取DNA。

【关键词】常量检材；Chelex-100提取法；DNA

法医DNA检验技术是一种分子生物学检验方式，其主要是利用DNA的独有性和个体识别性进行亲子鉴定和嫌疑人鉴定。法医DNA检验的主要对象为生物物证，也就是人体中的细胞核基因组，其通常存在于血液、唾沫中。目前，最常用的检测方法为Chelex-100提取法，主要是由于此种检测方式成本较低、操作方便、时间较短。笔者将对Chelex-100提取法在常量检材DNA提取中的作用进行研究。

1.资料与方法

1.1一般资料

选取20份送检的常量检材，包括烟蒂、染血棉签、纱条、FTA卡片等检材，其中烟蒂5份、棉签5份、纱条5份、FTA卡片5份。根据Chelex-100的浓度将所有检材分为三组，浓度5%为1组；10%为2组；15%为3组。1组将5gchelex-100溶液加纯水溶解至100ul；2组将10g chelex-100加纯水溶解至100ul；2组将15g chelex-100溶液加纯水溶解至100ul。

1.2检测方法

1.2.1血液DNA检测：将适量检材放置于离心管内震荡30s，放置于温室中浸泡，而后在13，000rpm条件下进行离心震荡，留取20μl基底液，而后加入Chelex-100和PK5-20μl，在56摄氏度下放置30-90min；在100摄氏度下放置5-20分钟，最后在10，000rpm条件下离心震荡2min，取上层清液备用。

1.2.2唾液DNA检测：将唾液斑检材将之与离心管中，加入0.5ml纯水，混匀，温室中浸泡30min，在13，000rpm条件下离心震荡3min，去除上清液；而后加入Chelex-100和PK5-20μl，在56摄氏度下放置30-90min；在98摄氏度下放置15分钟，震荡混匀，最后在13，000rpm条件下离心震荡2min，在4摄氏度下保存。而后将所有样本进行DNA扩增、电泳处理。

1.3效果比较

对三组检测的DNA浓度进行比较。

1.4数据统计

数据采用spss17.0软件处理，计量资料采用±S表示，资料采用t值检验，P<0.05认为差异具有统计学意义。

2.结果

三组DNA浓度比较无明显差异，P<0.05（详见表1）。

表1 三组DNA浓度比较

组别 浓度（ng/μl）

1组 2.31±0.2

2组 2.28±0.4

3组 2.49±0.3

P值 0.12

t值 1.23

3.讨论

近年来由于医学科技不断的发展，DNA检测技术逐渐普及，同时DNA检测方式也越来越多，目前主要有Chelex-100提取法、有机法、二氧化硅法、碱裂解法和盐析法。Chelex-100是一种树脂，对多价金属离子具有非常高的亲和力，其在低离子强度、碱性温浴的作用下能够裂解细胞膜，改变与DNA结合蛋白的性质[1]。通常来说，常量检材基质中含有大量的金属离子，在低离子强度和加热条件下能够降解DNA，同时能够抑制PCR反应，因此在提取DNA时加入Chelex-100能够阻止DNA降解，同时提升PCR扩增率[2]。但此种方式在临床中也存在一定的不足，Chelex-100提取法检测很容易受到基质中杂质的干扰，导致部分DNA丢失。但其在实践中操作非常方便，且时间非常短，在提取的过程中无需更换试管，大大降低了污染发生率[3]。此外，在研究中也可以看出，低浓度的Chelex-100与高浓度Chelex-100提取的DNA浓度并无明显差异，因此可以认为低浓度Chelex-100能够有效的提取常量检材DNA，降低了不必要的浪费和污染。

有机提取法主要是采用饱和酚、氯仿等物质按照不同比例进行混合，而后提取DNA的方式。DNA非常容易溶于水中，但不溶于有機溶剂中[4]。此种提取方式提取的DNA纯度非常高，不会受到杂质干扰，但此种方式由于在提炼过程中需要利用大量有机试剂进行辅助，有机试剂多存在较大的毒性，会对人体造成影响，且容易造成环境污染。此外，有机提取方式操作复杂、提取时间较长，已经很少被采用。

二氧化硅法在提取DNA的过程中同样存在操作复杂的特点，且此种检测方式的改良方式主要应用于微量检材的检测中，很少应用于常量检材的检验中[5]。碱裂解法在提取DNA时必须要及时进行DNA扩增处理，但对于法医检验来说，通常要将DNA模板保存一段时间，以进行重复检验和鉴定，因此碱裂解法在实践中不具备较强的可行性。盐析法的操作成本较低，非常适合进行大批量样本检测，且此种方式的提取的DNA纯度非常高，可以视为结果无蛋白质干扰。但此种方式在使用中也存在较大的限制，盐析法不仅需要大量的检材，同时无法对低于3cm×3cm的检材进行检测，此外，盐析法虽然提取的DNA纯度较高，但其DNA提取率非常低，因此利用率也非常低。

总的来说，Chelex-100常量检材DNA提取方式具有较高的可行性，是一种有效的DNA提取手段。

参考文献

[1]杨电.接触DNA检材提取纯化方法的比较及法医学应用[D].南方医科大学，2010.

[2]成振.Chelex-100 DNA模板用于H19印记基因座遗传多态性的检测及其在山西汉族人群中分布研究[D].山西医科大学，2012.

[3]Katie L， William， RMark D，et a1.Developmental validationof a multiplex qPCR assay for assessing the quantity and quality ofnuelegr DNA in forensic samples [J].Forensic Sci Int， 2007，170，35—45.

[4]姜伯玮，赵兴等.Qubit快速荧光定量系统在法医学中的应用[J].证据科学，2009，17（1），123-128.

[5]袁丽，鲁涤，刘耀.低拷贝DNA模板检验方法研讨[J].中国法医学杂志，2010，24（06），383-385.