反相高效液相色谱法测定西番莲中的有机酸

王琴飞 李莉萍 高玲 王明 应东山 张如莲

摘  要  采用Waters Atlantis C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），以2%甲醇-98% 0.01 mol/L K2HPO4溶液（用H3PO4调节pH2.8）作为流动相，流速为0.6 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为10 μL，检测波长为210 nm，建立高效液相色谱同时分析西番莲中10种有机酸的方法。结果表明：该方法相对标准偏差为0.22%～4.00%，平均回收率在88.0%～109.6%，各种酸的线性相关系数r>0.999 2，检测限为0.001～0.22 μg/mL;采用外标法定量。在紫果和黄果西番莲中检测到7种有机酸，其含量趋势呈现为柠檬酸>L-苹果酸>L-乳酸>琥珀酸>L-抗坏血酸>酒石酸>富马酸。该方法具有灵敏度高、测试组分多、速度快等优点，适用于西番莲中多种有机酸的测定。

关键词  反相高效液相色谱法;西番莲;有机酸

中图分类号  TS255.7          文献标识码  A

Analysis of Organic Acids in Passion Fruit by Reverse

Phase High Performance Liquid Chromatography

WANG Qinfei， LI Liping， GAO Ling， WANG Ming， YING Dongshan， ZHANG Rulian*

Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of

Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China/Ministry of Agriculture Quality

Control and Test Centre for Seeds/Seedlings of Tropical Crops， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract  A method for simultaneous determination of ten organic acids in passion fruit pulp by reverse phase high performance liquid chromatography was established. Waters Atlantis C18 column（150 mm×4.6 mm， 5 μm）was used at 30 ℃ and mobile phase was 2% CH3OH-0.01 mol/L K2HPO4（pH2.8）with flow rate of 0.6 mL/min. Detection wavelength was at 210 nm. The quantifidation was carried out by external stsndardization method. The relative standard deviations were 0.22%-4.00% and the average recoveries were 88.0%-109.6%. The correlation coefficients for the linear equations were above 0.999 2. and the detection limits were 0.001-0.22 μg/mL. The results indicated that the method was simple， rapid and accurate. The method was applied to the determination of organic acids in passion fruit. Seven organic acids were detected in P. edulis Sims and P. edulis f. flauicarpa Degener， and the trends of organic acids contents were present in citric acid>malic acid>lactic acid>succinic acid>ascorbic acid>tartaric acid>fumaric acid in passion fruit.

Key words  Reversed phase high performance liquid chromatography;passion fruit;Organic acid

doi  10.3969/j.issn.1000-2561.2015.08.025

西番莲（Passiflora edulis）俗称鸡蛋果，由于有浓郁而特殊的香味，也称为“百香果”，属西番莲科西番莲属，热带多年生草质至半木质藤本攀附果树，原产于澳大利亚和南美洲的巴西，现广泛分布于热带和亚热带地区。中国台湾、广东、广西、云南、海南等地种植西番莲已有很长的历史，并形成了一定的规模。西番莲成熟后果汁含量占果肉的80%以上，维生素含量70 mg/100 g，其酸度pH值在2.7～3.1[1]，有机酸含量可达4.0%，西番莲果汁的含酸量很高，糖酸比低，介于4.14 ∶ 1～1.66 ∶ 1，与人群口味认可的13 ∶ 1～15 ∶ 1相差甚远，原果汁无法直接饮用，需要加水稀释成果汁饮料或与其他低酸性果汁调配成混合果汁[2]。因此，西番莲除少量鲜食外，大部分都用于生产复合果汁、果酱和酸奶[3-5]。而有机酸是果汁酸味的主要成分，其种类和含量高低与果汁或果肉的品质和风味有极密切的关系，并且可通过测定各种有机酸的含量来鉴别果汁饮料掺假与否[6-7]。测定果品有机酸的方法很多，有气相色谱法[8]、离子色谱法[9-11]、高效液相色谱法等[1， 6， 12-14]。高效液相色谱法前处理比较简单，具有准确度高、重现性好等优点，可同时测定样品中多种有机酸，目前应用最为广泛。研究者常以柠檬酸和苹果酸作为西番莲酸味的代表性酸[4， 15]，而西番莲中有机酸种类和多种有机酸的液相色谱检测方法还未见报道。本研究拟建立一种高效液相色谱方法同时测定西番莲中10种有机酸，为分析西番莲果汁中有机酸的种类提供检测依据，同时也为西番莲果汁加工产业提供理论参考。

1  材料与方法

1.1  材料

紫果西番莲（Passiflora edulis Sims）和黄果西番莲（P. edulis f. flauicarpa Degener）夏季采摘于农业部植物新品种测试分中心（儋州）西番莲种质资源圃。于黄果果皮呈黄色、紫果果皮紫色面积大于整果的2/3时采摘。采摘健康、果型完整的果实带回实验室后，立即取出果肉，用密封袋保存于-40 ℃冰箱内待用。

标准样品草酸（oxilic acid）、酒石酸（tartaric acid）、奎宁酸（quinic acid）、L-苹果酸（malic acid）、L-抗坏血酸（ascorbic acid）、L-乳酸（lactic acid）、乙酸（acetic acid）、柠檬酸（citric acid）、富马酸（fumaric acid）、琥珀酸（succinic acid）、甲醇（色谱纯）购买于美国Sigma公司，磷酸、磷酸氢二钾为分析纯。

采用Aglent1260型液相色谱系统分析上述10种有机酸，配备自动进样器（型号：G1329B）、二极管阵列列检测器（型号：G1315D）和柱温箱（型号：G1316A）。色谱柱为Atlantis C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），购买于美国Waters公司;超纯水由Elix3+Synergy超纯水系统制备，购买于美国Millipore公司;超声波清洗器（KQ-400KDE）购买于江苏昆山市超声仪器有限公司。

1.2  方法

1.2.1  西番莲有机酸的提取   称取冰冻的西番莲果肉5.00 g放入研钵中，加入10 mL 0.01 mol/L的K2HPO4溶液（pH2.8），冰上研磨使果肉与种子完全分离，将研磨后的样品缓慢倒入50 mL容量瓶，用0.01 mol/L的K2HPO4溶液冲洗研钵3次，并定容至50 mL，放入超声波清洗器中超声提取30 min（超声频率为320 kHz，温度为30 ℃），过滤后取滤液离心（10 000×g，20 min），上清液经0.22 μm滤膜过滤后直接进样。每个样品做3次重复。

1.2.2  有机酸标准溶液的配制   分别称取适量的标准样品L-苹果酸、柠檬酸，用超纯水定容至25 mL，配置成质量浓度为20 mg/mL单标母液;草酸、酒石酸、奎宁酸、L-抗坏血酸、L-乳酸、乙酸、富马酸、琥珀酸配置成质量浓度为1 mg/mL的单标母液，于4 ℃冰箱保存。使用时，将其依次稀释配置成不同浓度的混合标准溶液，经0.22 μm滤膜过滤后使用。

1.2.3  色谱条件   Waters Atlantis C18色谱柱（150 mm×4.6 mm， 5 μm），流动相为2%甲醇-98% 0.01 mol/L K2HPO4溶液（用H3PO4调节pH2.8），流速为0.6 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为10 μL，检测波长为210 nm。

2  结果与分析

2.1  检测波长的确定

通过紫外波长190～300 nm对10种有机酸的标准溶液进行扫描，结果表明，9种有机酸在210 nm附近有最大吸收峰，只有L-抗坏血酸在240 nm下有最大吸收峰，考虑到多种有机酸一次性检测，因此，在210 nm波长下进行检测。

2.2  流动相种类的选择

采用高效液相色谱法测定果品中有机酸的报道很多，但使用的流动相种类和pH都不相同，常用的流动相有NaH2PO4、KH2PO4、K2HPO4等[6， 16-18]，pH根据色谱柱的不同从2.1变化到2.9，通过比较不同的流动相种类（pH2.5，柱温30 ℃，流速0.5 mL/min），得到10种有机酸的保留时间（图1），虽然在保留时间差异不大，但在使用0.01 mol/L的NaH2PO4、KH2PO4分析这10种有机酸时，酒石酸和奎宁酸、抗坏血酸和乳酸都不能完全分离，而K2HPO4更适合该色谱柱的流动相分离这10种有机酸，10种有机酸能得到有效分离。因高浓度的盐对色谱柱的寿命有影响，因此本实验采用0.01 mol/L的K2HPO4作为流动相。

2.3  流动相pH的选择

以2.2中0.01 mol/L K2HPO4作为流动相，以H3PO4调节不同的pH值，测定10种有机酸的保留时间。结果表明，流动相pH值对有机酸保留时间影响较大（图2）。当pH为2.2～2.4时，酒石酸和奎宁酸完全不能分离，随着pH的增大，分离效果越好;但pH为2.6～2.7时，富马酸和琥珀酸不能分离;在pH2.8时，这2种有机酸的出峰顺序发生改变;而在pH达到3.0时，乙酸和柠檬酸不能基线分离，因此，选择pH2.8的0.01 mol/L K2HPO4作为流动相筛选后续的因子。

2.4  流动相中甲醇含量的选择

流动相中加入少量甲醇，可改善有机酸的峰形，但高比例的甲醇会使得柱压升高，柠檬酸和乙酸也完全不能分离[6]。因此，在2.3的优化条件下，比较了0～4%甲醇比例下10种有机酸的分离效果（图3）。结果表明，随着甲醇比例的增加，出峰时间缩短;甲醇比例为0时，各种有机酸拖尾严重，L-抗坏血酸和L-乳酸的分离度也低;但当甲醇比例达到4%时，酒石酸和奎宁酸的出峰时间重合，L-苹果酸和L-抗坏血酸分离度降低。虽然甲醇比例为1%时分离效果好，但分离时间较长，样品中杂质对L-抗坏血酸和L-乳酸的分离度干扰较大，综合考虑分离时间和分离效果，2%的甲醇比例更为合适。因此，选择出峰时间较短、峰形较好、甲醇比例为2%进行后续单因素实验。

2.5  色谱柱温度的选择

在2.4较优色谱条件下，考察了不同的柱温对10种有机酸的分离情况（图4），结果表明，柱温的增加可缩短分析时间，对有机酸的出峰顺序没有影响。柱温过低，酒石酸和奎宁酸分离度不好;而柱温过高，乙酸和柠檬酸的分离度降低。L-抗坏血酸和L-乳酸的分离度随柱温的增加而变大。在柱温为30 ℃时，10种有机酸能在10 min左右分析完成，因此，可选择分离较好的30 ℃柱温进行后续因子的筛选实验。

2.6  其它条件的选择

以2%CH3OH-K2HPO4（pH2.8）溶液作为流动相，在柱温30 ℃条件下，比较了流速0.2～1 mL/min对保留时间的影响。结果发现，随着流速的升高，10种有机酸的分离时间减少;流速为0.2 mL/min时，10种有机酸需要25 min才能全部出峰;而流速过快，10种有机酸的分离度也降低，柱压升高，不利于色谱柱的保护和长期使用。因此，以柱压较低，分离度较好，出峰时间在10 min左右完成10种有机酸分离的0.6 mL/min流速进行实验。。

2.7  分离条件的优化

综合以上单因素条件优化的实验，以卢佩章提出的串行色谱响应函数HCRF[19]，对单因素分离条件进行比较，最终得到优化的条件：（1）流动相为2%CH3OH-0.01 mol/L K2HPO4（pH2.8）;（2）流速为0.6 mL/min; （3）柱温为30 ℃。图5为该条件下测定的10种有机酸的标准样品和西番莲样品的色谱图和加标样品图，10种有机酸在11 min内均得到有效分离。

2.8  标准曲线、检出限、精密度及回收率

在上述得到的最优条件下，将有机酸单标母液稀释成5个浓度梯度的有机酸混合标准溶液，分别进样10 μL，以峰面积y对质量浓度（x，μg/mL）作图，制作标准曲线（表1），并对结果进行回归分析，由表1可知，各有机酸的相关系数在0.999 2～1.0范围内，线性关系良好。再以3倍信噪比（S/N）时，各有机酸的浓度作为最小检测限（表1）。

取紫果西番莲样品5份，采用1.2.1的方法提取有机酸，经0.22 μm滤膜过滤后上样，用于考察方法的精密度（表1），10种有机酸的RSD在0.22%～4.00%。另取同一样品4份，1份作为本底，参照王冉等[20]的方法，另外3份样品分别按紫果西番莲样品有机酸总量的80%、100%、120%加入有机酸混合标样，每个浓度设3个重复，如表1所示，得到各有机酸的平均回收率在88.0%～109.6%。表明该方法准确灵敏、重现性好、回收率高。

2.9  西番莲样品中有机酸定量分析

用优化的色谱条件，分析了紫果和黄果西番莲果肉中有机酸的含量和种类，结果见表2，紫果和黄果西番莲中有7种相同的有机酸，而草酸、奎宁酸和乙酸都未检测到;7种有机酸含量以柠檬酸最高，紫果和黄果西番莲的含量分别达到了14.8、19.1 mg/g，富马酸含量最低。紫果西番莲中酒石酸和L-抗坏血酸含量高于黄果西番莲，2种西番莲中L-苹果酸含量基本相同，其他5种有机酸含量都是黄果西番莲较高。7种有机酸的含量趋势呈现为柠檬酸>L-苹果酸>L-乳酸>琥珀酸>L-抗坏血酸>酒石酸>富马酸。

3  讨论与结论

本实验比较了10%乙醇和流动相常温超声提取2种方法提取西番莲果肉中的有机酸[9]，虽然超声提取过程中L-抗坏血酸的含量有所下降，但样品中柠檬酸的含量却明显增加，7种有机酸总量也达到最大值;但2种提取方法中7种有机酸总含量差异不显著（数据未发表），因此选择以流动相直接提取的方法更方便快捷，采用超声提取的方法以提高提取效率[21-22]。同时，选择了冰上研磨匀浆，防止抗坏血酸的进一步降解。

有机酸是果实风味的重要组成部分，多数鲜果以苹果酸和柠檬酸为代表[9]，但也有很多水果有其特殊的有机酸，如杨梅果实中琥珀酸的含量最高[16];葡萄果实中酒石酸含量仅次于苹果酸[23]。果品中有机酸种类的不同，因此赋予了不同果品味道的差异[14， 24]。紫果和黄果西番莲中有机酸种类相同，但各种有机酸含量都有所差异，这可能是品种的差异所致，2种西番莲中有机酸都以爽快可口的柠檬酸和L-苹果酸为主要的酸味物质，与菠萝的酸味特点相似[25];同时，西番莲果肉中存在大量的乳酸，含量仅次于L-苹果酸，该有机酸是发酵食品中的代表性酸，酸味柔和[26]，而很多果品中该酸不存在或含量较低，这使得西番莲果汁成为酸奶制品的添加成分成为可能。在样品中还检测到高含量的琥珀酸，该酸常作为评价葡萄酒口感的一个特征酸，能赋予产品鲜美的味道[27]。同时，在西番莲果肉中还检测了较高含量的L-抗坏血酸，其含量仅次于鲜榨的橙汁[6]。而样品中没有检测到口感为发涩或苦味的草酸、奎宁酸和较强刺激味的乙酸[20， 26]。结果证明，紫果和黄果西番莲中有机酸种类丰富，味道独特，可作为“天然的浓缩果汁”，在果汁和果酱加工中应用。但西番莲收获期可从一年的7月中下旬持续到12月底，不同的采收时期和贮藏过程中果汁品质差异大，有机酸及其糖分的变化也较大[2]，因此，不同采收时期和贮藏方式有机酸种类和含量变化有待进一步研究探索，才能在西番莲复合果汁等产品加工中提供准确的参考依据。

本研究采用Waters Atlantis C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），以2%甲醇-98% 0.01 mol/L K2HPO4溶液（用H3PO4调节pH2.8）作为流动相，流速为0.6 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为10 μL，检测波长为210 nm，分析了紫果和黄果西番莲中10种有机酸。该方法具有灵敏度高、测试组分多、速度快等优点，适用于西番莲中多种有机酸的测定。

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