超声微波协同提取橄榄多糖及其脱蛋白工艺的研究

陈燊 曾红亮 陈万明 张怡

摘  要  为了研究超声微波协同提取橄榄多糖及其脱蛋白工艺，通过考察超声波功率、微波功率和提取时间等3个单因素对多糖得率影响的基础上，采用正交试验对超声微波协同提取橄榄多糖的工艺条件进行优化，并采用酶法对橄榄粗多糖脱蛋白工艺进行研究。结果表明，超声微波协同提取橄榄多糖的最佳工艺条件为：超声波功率为250 W、微波功率为150 W和提取时间为15 min，在此条件下，橄榄多糖的得率为（10.6±0.3）%;橄榄多糖酶法脱蛋白的最佳工艺条件为：酶解温度为40 ℃、酶解时间为70 min和酶添加量为70 U/g，在此条件下，橄榄多糖脱蛋白率为（77.0±2.5）%。超声微波协同提取法是一种快速有效的提取橄榄多糖的方法。

关键词  橄榄;多糖;超声微波协同提取;脱蛋白

中图分类号  TS201.1          文献标识码  A

Technology of Ultrasonic/Microwave Assisted Extraction

and Deproteinization of Polysaccharides from

Canarium album（Lour.）Raeusch

CHEN Shen，ZENG Hongliang，CHEN Wanming，ZHANG Yi*

College of Food Science， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract  Ultrasonic/microwave assisted extraction（UMAE） and deproteinization of polysaccharides from Canarium album（Lour.）Raeusch （CPS） were studied. The effects of ultrasonic power， microwave power and extraction time on the yield of CPS were investigated， respectively. Based on single factor experiments， the extraction technology of CPS extracted by UMAE was optimized by the orthogonal test. Moreover， the technology of deproteinization of crude CPS was studied using papain. The results showed that the optimum extraction conditions were as follows： ultrasonic power of 250 W， microwave power of 150 W and extraction time of 15 min. Under these conditions， the yield of polysaccharides could be up to （10.6±0.3）%. The optimum conditions of deproteinization were as follows： temperature of 40 ℃， time of 70 min and content of enzyme of 70 U/g. Under the above conditions，the rate of deproteinization could reach to （77.0±2.5）%. UMAE was an attractive method for extracting CPS with fast speed and high efficiency.

Key words   Canarium album（Lour.）Raeusch;Polysaccharides;Ultrasonic/microwave assisted extraction;Deproteinization

doi  10.3969/j.issn.1000-2561.2015.08.021

橄榄[Canarium album（Lour.）Raeusch]又名青果、福果，是橄榄科橄榄属植物的果实，是热带、亚热带的名优水果之一[1]。橄榄原产于中国东南地区，主要分布在福建、广东、台湾、四川、云南、浙江等省[2]。福建省闽侯县被称为“中国橄榄之乡”，其橄榄品种多样，栽培面积广，产量大[3]。橄榄营养价值很高，含有人体所需多种维生素、氨基酸、多糖、黄酮等活性物质，具有清热、利咽、祛痰、生津、健脾、解毒等功效，是医食兼优的时令佳果[4-5]。目前，对于橄榄的研究主要针对其民间药膳、防腐保鲜、果汁、蜜饯等方面，对其活性成分的研究还处于初步阶段。

多糖是由一定数量的单糖通过一定的糖苷键脱水缩合成的多聚糖，是生命有机体不可缺少的组成部分，是生物体内除蛋白质和核酸以外又一类重要的生物大分子[6-7]。多糖参与了细胞的各种生命现象及生理过程的调节，具有多种生物学功能，如：抗肿瘤、提高机体免疫力、抗氧化、降血糖、降血脂等[8-11]。多糖传统水提法提取比较耗时、提取率低[12];酸碱提取法容易导致多糖结构的破坏，不利于后续构效关系的研究[13-14];超声波辅助法和微波辅助法操作简单，且不会引入杂质，多糖纯度高，但多糖得率和产能有待提高[15]。寻找高得率且具有产业化应用潜力的提取方法至关重要。超声微波协同提取法是近年发展起来的一种新方法，该方法充分利用超声波的振动空化作用和微波的高能作用，具有高效、快速、安全和环保等特点，已被广泛地应用于天然产物有效成分的提取，尤其在色素、黄酮和多糖等活性物质提取效果更好[16-17]。

因此，笔者采用超声微波协同提取法提取橄榄多糖，在考察超声波功率、微波功率和提取时间等3个单因素对多糖得率影响的基础上，通过正交试验确定超声微波协同提取橄榄多糖的工艺条件，在此基础上，对橄榄多糖酶法脱蛋白工艺进行了研究，旨在为研究橄榄多糖的结构、功能学特性及其综合开发利用提供一定的理论依据。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  材料与试剂   橄榄购于福建省闽侯县;木瓜蛋白酶，北京奥博星生物技术责任有限公司;牛血清蛋白，上海励瑞生物科技有限公司;考马斯亮蓝G-250，国药集团化学试剂有限公司;苯酚、浓硫酸、乙醇、石油醚、葡萄糖等均为国产分析纯试剂;本试验用水均为双蒸水。

1.1.2  仪器与设备   XH-300B微波超声波组合催化合成萃取仪，北京祥鹄科技发展有限公司;RE-52A型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂;BCD-213KC型新飞冰箱，河南新飞电器有限公司;FZ102植物粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司;AL104型精密分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司;丹瑞HH-6型数显恒温水浴锅，江苏省金坛市荣华仪器制造有双捷实验仪器厂;L530型台式低速离心机，长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司;Unic-UV-2000型紫外可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司;卤素快速水分测定仪，深圳市冠亚电子科技有限公司;SHA-B水浴恒温振荡器，常州国华电器有限公司;LG-1.0型真空冷冻干燥机，新阳速冻设备制造有限公司。

1.2  方法

1.2.1  样品前处理   筛选出无任何机械损伤、病虫害的新鲜果实，对其进行清洗、去核，经冷冻干燥后，粉碎过筛（100目），得到橄榄粉末（水分含量<3%），备用。

1.2.2  多糖的提取   提取流程：橄榄粉末→超声微波协同提取→离心→滤液→减压浓缩→醇析→离心→沉淀→定容测定。

取2 g橄榄粉末加入100 mL水中，在不同超声波功率、微波功率条件下提取不同时间，浑浊液经离心后，取滤液经减压浓缩后静置于4倍体积无水乙醇中沉降24 h，然后离心弃去上清液，沉淀经定容后测定。重复3次。

1.2.3  多糖得率的测定   以葡萄糖为标样，采用硫酸―苯酚比色法测定[18]。

标准曲线溶液配制：精确称取干燥的葡萄糖标样20 mg，用500 mL蒸馏水定容，分别吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，并用蒸馏水补至2.0 mL，然后加入1.0 mL 6%苯酚，再迅速加入5.0 mL浓硫酸，显色后在冷水中冷却15 min，在波长490 nm处测定吸光度OD值，以蒸馏水代替葡萄糖作空白对照。

样品测定：吸取1.0 mL样品液按照上述步骤操作，在波长490 nm处测定吸光度OD值，以标准曲线计算多糖得率。

多糖得率计算公式：

多糖得率/%=■×100

1.2.4  蛋白质含量测定   标准曲线溶液配制：精确移取牛血清白蛋白标准溶液（浓度为0.1 mg/mL）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置试管中，加入去离子水，使每支试管中溶液体积为1 mL，摇匀。然后每管中分别加入5.0 mL染色液，摇匀，室温静置3 min，于波长595 nm处测定吸光度OD值，以空白溶液作对照。

样品测定：吸取1.0 mL样品液按照上述步骤操作，在波长595 nm处测定OD值，以标准曲线计算蛋白质浓度。

1.2.5  超声微波协同提取橄榄多糖   单因素试验：取2 g金柑粉末，加入100 mL水，以橄榄多糖得率为指标，研究超声波功率、微波功率和提取时间对多糖得率的影响。

正交试验：根据单因素试验结果，选取超声波功率（X1）、微波功率（X2）、提取时间（X3）等3因素，各3个水平，以多糖得率为指标，按L9（34）正交表试验，得出超声微波协同提取橄榄多糖的最佳工艺参数。

1.2.6  橄榄多糖酶法脱蛋白   单因素试验：精确称取2 g橄榄多糖，配制成2 mg/mL，pH6.5多糖溶液，以脱蛋白率为指标，研究木瓜蛋白酶酶解时不同的酶解温度、酶解时间、酶添加量对脱蛋白率的影响。

正交试验：根据单因素试验结果，选取酶解温度（X1）、酶解时间（X2）、酶添加量（X3）3因素，各3个水平，以脱蛋白率为指标， 按L9（34）正交表做试验，得出橄榄多糖酶法脱蛋白的最佳工艺参数。

脱蛋白率计算公式：

脱蛋白率/%=■×100

公式中c1：脱蛋白前的蛋白质浓度（μg/mL）;c2：脱蛋白后的蛋白质浓度（μg/mL）。

2  结果与分析

2.1  标准曲线

多糖标准曲线：y=7.216 1x+0.041 5（r2=0.999 7）。表明0～0.08 mg/mL葡萄糖含量与y呈良好的线性关系。x—表示葡萄糖含量（mg/mL）;y—表示在波长490 nm处吸光度OD值。

蛋白质标准曲线：y=0.006 4x+0.003（r2=0.999 7）。表明在0～100 μg/mL牛血清白蛋白溶液浓度与吸光度OD值呈良好的线性关系。x—表示牛血清白蛋白溶液浓度（μg/mL）;y—表示吸光度OD值。

2.2  超声微波协同提取橄榄多糖工艺研究

2.2.1  超声波功率对橄榄多糖得率的影响   当微波功率为100 W，提取时间为10 min条件下，试验结果见图1。超声波功率在100～250 W时，多糖得率随超声波功率的增加而增加，但当超声波功率高于250 W时，多糖得率随着超声波功率增加而减少，这可能是由于过高的超声波功率会导致多糖降解[19]。因此，选择250 W为实验最佳的超声波功率。

2.2.2  微波功率对橄榄多糖得率的影响   当超声波功率为250 W，提取时间为10 min条件下，试验结果见图2。微波功率在25～150 W时，多糖得率随微波功率增加而增加，但当微波功率高于150 W时，多糖得率随着微波功率增加而减少，这可能是由于过高的微波功率导致多糖降解[20]。因此，选择150 W为实验最佳的微波功率。

2.2.3  提取时间对橄榄多糖得率的影响   当超声波功率为250 W，微波功率为150 W条件下，试验结果见图3。提取时间在5～15 min时，多糖得率随提取时间增加而增加，但当提取时间超过15 min时，多糖得率随着提取时间增加而减少，这可能是由于过长的超声波和微波作用时间会使多糖分子链发生断裂，从而降低多糖的得率。因此，选择15 min为实验最佳的提取时间。

2.2.4  提取工艺的确定   在单因素试验基础上，用正交试验对影响橄榄多糖得率的因数进行条件优化（表1）。

由表2可知，各因素对橄榄多糖得率的影响大小依次为：超声波功率>微波功率>提取时间;超声微波协同提取橄榄多糖的最佳工艺条件为：A2、B2和C2，即超声波功率250 W，微波功率150 W，提取15 min。

由表3可知，超声波功率和微波功率对橄榄多糖得率影响达极显著水平，提取时间对橄榄多糖得率影响达显著水平。在最佳工艺条件下，橄榄多糖得率为（10.6±0.3）%。

2.3  橄榄多糖酶法脱蛋白工艺研究

2.3.1  酶解温度对脱蛋白率的影响   当酶解时间60 min，酶添加量50 U/g时，结果见图4。酶解温度在10～40 ℃时，脱蛋白率随酶解温度增加而增加，但当酶解温度超过40 ℃时，脱蛋白率随着酶解温度增加而减少，这可能是因为当温度超过酶的最适反应温度后，酶蛋白质变性，使得酶活力减弱，直至完全丧失活力，反应速度随着温度升高迅速下降[21]。因此，选择40 ℃为实验最佳的酶解温度。

2.3.2  酶解时间对脱蛋白率的影响   当酶解温度为40 ℃，酶添加量为50 U/g时，结果见图5。当酶解时间在40～70 min时，脱蛋白率随酶解时间增加而增加，但当酶解时间超过70 min时，脱蛋白率几乎不变，这是由于酶解反应时间和酶解进行程度有密切的关系，反应时间太短，酶解不充分;而当酶浓度达到一定时，酶促反应的时间延长并不能使脱蛋白率显著增加[22]。因此，选择70 min为实验最佳的酶解时间。

2.3.3  酶添加量对脱蛋白率的影响   当酶解温度为40 ℃，酶解时间为70 min时，结果见图6。酶添加量在30～60 U/g时，脱蛋白率随酶添加量增加而增加，但当酶添加量超过60 U/g时，脱蛋白率几乎不变。因此，选择60 U/g为实验最佳的酶添加量。

2.3.4  脱蛋白工艺的确定   在单因素试验基础上，用正交试验对影响橄榄多糖脱蛋白率的因数进行条件优化（表4）。

由表5可知，各因素对橄榄多糖脱蛋白率的影响大小依次为：酶解温度>酶解时间>酶添加量;橄榄多糖酶法脱蛋白的最佳工艺条件为：A′2、B′2和C′3，即酶解温度40 ℃、酶解70 min，酶添加量70 U/g。

由表6可知，酶解温度对橄榄多糖脱蛋白率影响达极显著水平，酶解时间和酶添加量对橄榄多糖脱蛋白率影响达显著水平。在最佳工艺条件下，橄榄多糖脱蛋白率为（77.0±2.5）%。

3  讨论与结论

超声波-微波协同法将振动超声与开放式微波两种作用方式相结合。充分利用超声振动的空化作用以及微波的高能作用，使样品各点内受到的作用一致。降低目标物与样品基体的结合力，加速目标物从固相进入溶剂的过程。而单独微波辅助提取法主要是利用微波穿透强、加热快的特点，使植物细胞内迅速产生大量的热量，增强细胞内的压力，冲破细胞，使活性成分溶出。李永裕等[23]橄榄多糖微波辅助提取工艺研究中，采用微波前处理-热水浸提，在最优条件下得到的橄榄多糖得率为9.38%，相比本研究结果有所提高。

超声微波协同提取法充分利用了超声波的振动空化作用和微波的高能作用，提取效率高，多糖纯度高。超声微波协同提取法是一种快速有效的提取橄榄多糖方法，但各种提取方法对橄榄多糖结构和活性的影响有待进一步研究。

传统脱蛋白方法有盐析法、TCA法、Sevag法，都存在着有机溶剂量大，耗时长，水相与有机相的分离，容易造成损失等缺点。现尝试以酶法脱除多糖中的蛋白质，以期为将来的生产提供理论依据。酶法能有效除去橄榄粗多糖中蛋白质杂质，本研究使用木瓜蛋白酶脱除橄榄粗多糖的蛋白质，相较于之前贾媛颖[24]用SEVAGE法脱除蛋白方法，不引入有机试剂，因而能够较好应用于工业生产中，为进一步研究橄榄多糖理化性质、分离纯化、结构表征、构效关系及其综合开发利用提供基础。

参考文献

[1] 陈  婕. 橄榄浓缩汁加工技术的研究[D]. 福州： 福建农林大学， 2012.

[2] 吴如健， 韦晓霞， 潘少林，等. 福建省橄榄种质资源圃的建立[J]. 福建果树， 2009（3）： 1-5.

[3] 欧高政，陈清西. 橄榄果实膳食纤维含量及动态变化研究[J]. 福建农业学报， 2009， 24（1）： 64-67.

[4] 张  怡， 李玲望， 曾红亮，等. 橄榄汁保肝作用及其功效成分的研究[J]. 营养学报， 2012， 34（4）： 379-383.

[5] 常  强， 苏明华，陈清析. 橄榄叶化学成分及药理作用研究概[J]. 热带作物学报， 2013， 34（8）： 1 610-1 616.

[6] 曾红亮. 金柑多糖提取、 分离纯化及抑菌抗氧化活性的研究[D]. 福州： 福建农林大学， 2012.

[7] Wang M， Jiang C， Ma L， et al. Preparation， preliminary characterization and immunostimulatory activity of polysaccharide fractions from the peduncles of Hovenia dulcis [J].  Food Chemistry， 2013， 138（1）： 41-47.

[8] Wu W， Zhu Y， Zhang L， et al. Extraction， preliminary structural characterization， and antioxidant activities of polysaccharides from Salvia miltiorrhiza Bunge[J]. Carbohydrate Polymers， 2012， 87（2）： 1 348-1 353.

[9] Zhao L， Dong Y， Chen G， et al. Extraction， purification， characterization and antitumor activity of polysaccharides from Ganoderma lucidum[J]. Carbohydrate Polymers， 2010， 80（3）：783-789.

[10] Senchenkova S Y N， Shashkov A S， Shneider M M， et al. Structure of the capsular polysaccharide of Acinetobacter baumannii ACICU containing di-N-acetylpseudaminic acid[J]. Carbohydrate Research， 2014， 391： 89-92.

[11] Xiong Q， Li X， Zhou R， et al. Extraction， characterization and antioxidant activities of polysaccharides from E. corneum gigeriae galli[J]. Carbohydrate Polymers， 2014， 108： 247-256.

[12] 曾红亮， 卢 旭， 卞贞玉， 等. 响应面分析法优化金柑多糖的提取工艺[J]. 福建农林大学学报（自然科学版）， 2012， 41（3）：315-319.

[13] Tahmouzi S， Ghodsi M. Optimum extraction of polysaccharides from motherwort leaf and its antioxidant and antimicrobial activities[J]. Carbohydrate Polymers， 2014， 112： 396-403.

[14] 任初杰， 高  丽， 王承明. 碱提花生粕水溶性多糖工艺研究[J]. 农业工程学报， 2008， 24（7）： 251-254.

[15] Passos C P， Coimbra M A. Microwave superheated water extraction of polysaccharides from spent coffee grounds[J]. Carbohydrate Polymers， 2013， 94（1）： 626-633.

[16] Cheng X L， Wan J Y， Li P， et al. Ultrasonic/microwave assisted extraction and diagnostic ion filtering strategy by liquid chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry for rapid characterization of flavonoids in Spatholobus suberectus[J]. Journal of Chromatography A， 2011， 1 218（34）： 5 774-5 786.

[17] Chen Y， Gu X， Huang S-Q， et al. Optimization of ultrasonic/microwave assisted extraction （UMAE） of polysaccharides from Inonotus obliquus and evaluation of its anti-tumor activities[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2010， 46（4）： 429-435.

[18] 张  怡， 曾红亮， 曾绍校，等. 金柑多糖酶法脱蛋白工艺的研究[J]. 热带作物学报， 2012， 33（1）： 166-170.

[19] Lou Z， Wang H， Zhu S， et al. Ionic liquids based simultaneous ultrasonic and microwave assisted extraction of phenolic compounds from burdock leaves [J]. Analytica Chimica Acta， 2012， 716： 28-33.

[20] Tian Y， Zeng H， Xu Z， et al. Ultrasonic-assisted extraction and antioxidant activity of polysaccharides recovered from white button mushroom （Agaricus bisporus） [J]. Carbohydrate Polymers，2012， 88（2）： 522-529.

[21] 孙诗清. 蛹虫草废弃培养基多糖不同脱蛋白方法的比较研究[J]. 广州化工， 2010， 38（1）： 128-130.

[22] 李向东， 惠和平， 封士兰，等. 红芪多糖的脱蛋白及脱色素工艺[J]. 生物医药， 2010， 17（3）： 40-41.

[23] 李永裕， 贾媛颖， 吴少华.微波辅助提取橄榄多糖的工艺研究[J]. 中国农学通报， 2012， 28（36）： 300-305.

[24] 贾媛颖. 橄榄多糖提取、 分离及性质研究[D]. 福州： 福建农林大学， 2012.