表观遗传修饰炎症相关基因在高血糖“代谢记忆”中的作用及机制

徐 瑾 廖云飞 衷诚群 杨 娟

(宜昌市第二人民医院 三峡大学第二人民医院，湖北 宜昌 443000)

早期高血糖导致的血管损伤在血糖控制至正常水平后仍持续存在，并成为后期血管病变发生发展的重要致病因素之一;而在早期控制高血糖至理想水平，则可以延缓甚至阻断血管并发症的形成;这一现象被称之为高血糖“代谢记忆”〔1〕。已有研究证明，高血糖的“代谢记忆”可被靶细胞的表观遗传改变〔2〕。本文分析表观遗传修饰炎症相关基因在高血糖“代谢记忆”中的作用及相关机制。

1 资料与方法

1.1 实验动物 Wistar大鼠 购自南京君科生物工程有限公司，均为雄性，6周龄，体重150～170 g，60只大鼠随机分为正常对照组、高糖组、代谢记忆组各20只。其中高糖组采用链脲佐菌素(STZ)溶液腹腔内注射，高糖状态持续24 w;代谢记忆组采用STZ溶液腹腔内注射，诱导成模后高糖状态持续12 w后，随后使用胰岛素控制血糖至正常范围，胰岛素正常状态持续12 w。

1.2 实验试剂和仪器 主要实验试剂:细胞、组织总RNA提取试剂盒、STZ、Luciginin、apocynin、L-NAME、DPI购自美国 Sigma公司、PrimeScript逆转录试剂盒和SsoAdvanced实时定量试剂盒购自美国Bio-Rad公司、超氧化物阴离子荧光条件(DHE)和活性氧簇细胞渗透性指示剂(CM-H2DCFDA)购自美国 Life technologies公司、内源性一氧化氮合酶(eNOS)抗体和PhosphoeNOS(Serl177)抗体购自美国CST公司。

主要实验仪器:CFX96实时PGR仪和ChemiDoc XRS+化学发光成像系统购自美国Bio-Rad公司、F-4500荧光分光光度计购自美国Themo公司、Olympus 1X71倒置荧光显微镜购自日本Olympus公司、Amexa Nucleofector核酸电转染仪购自德国Amexa公司。

1.3 实验方法 造模喂养24 w后，麻醉处死大鼠，解剖分离大鼠主动脉组织，清除主动脉组织周围结缔组织及血污，将游离主动脉送往氧化应激及NO生物活性检测，操作如下:取15 mg主动脉组织置入250μl裂解液中，将其研磨粉碎，将15μl蛋白酶K及550μl RNase-free ddH2O滴入研磨后浆液中，56℃温箱内静置15 min，1 500 r/min离心，取上清。将0.5倍体积无水乙醇滴入上清液中，混合均匀，将溶液转入CR3吸附柱中，1 500 r/min离心，弃废液，收回吸附柱;将300μl去蛋白液RW1加入置CR3吸附柱内，1 500 r/min离心，弃废液，收回吸附柱;再依次将75μl DNaseI工作液、350μl去蛋白液RW1及450μl漂洗液RW加入到CR3吸附柱内，同上离心、弃废液，收回吸附柱操作，最终将吸附柱置于新离心管内，加入60μl RNase-free ddH2O，静置5 min，1 500 r/min离心，最终得到RNA溶液。取2μl RNA溶液置于分光光度计内检测，记录单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、细胞间黏附分子(ICAM)-1、IL-6 mRNA表达水平、eNOS基因表达和eNOS(Ser-1177)磷酸化水平。NO活性水平、活性氧(ROS)水平检测选用荧光探针检测，操作严格按仪器说明书进行。

1.4 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件进行t检验。

2 结果

2.1 3组主动脉血管内皮功能对比 正常对照组NO含量显著高于高糖组和代谢记忆组，而MCP-1、ICAM-1和IL-6 mRNA表达则显著低于高糖组和代谢记忆组(P＜0.01);代谢记忆组NO含量显著高于高糖组，而MCP-1、ICAM-1和IL-6 mRNA表达则显著低于高糖组(P＜0.01)。见表1。

2.2 3组主动脉血管组织ROS水平对比 正常对照组DHE和CM-H2DCFDA荧光强度显著低于高糖组和代谢记忆组(P＜0.01);代谢记忆组的DHE和CM-H2DCFDA荧光强度显著低于高糖组(P＜0.01)。见表1。

表1 3组主动脉血管内皮功能、血管组织ROS水平对比(x±s，n=20)

2.3 3组主动脉血管组织eNOS基因表达和eNOS(Ser-1177)磷酸化水平比较 正常对照组eNOSmRNA和蛋白表达水平显著低于高糖组和代谢记忆组，而Ser-1177磷酸化水平显著高于高糖组和代谢记忆组(P＜0.01);代谢记忆组的eNOSmRNA和蛋白表达水平显著低于高糖组，而Ser-1177磷酸化水平显著高于高糖组(P＜0.01)。见表2。

表2 3组主动脉血管组织eNOS基因表达和eNOS(Ser-1177)磷酸化水平比较(x±s，n=20，%正常对照组)

3 讨论

表观遗传特指基因于核苷酸序列不变的情况下出现表达活性的可遗传性改变，其具有无DNA序列变化、可遗传，并且可能引发基因活性及功能变化的特征。表观遗传变化诱因可能表现为环境、饮食以及药物影响等〔3〕。表观遗传可以对基因表达激活或者抑制进行修饰及调节，早期大鼠的高血糖可诱导血管eNOS基因出现表观遗传，大鼠eNOS表达活性出现改变。而血管eNOS则可生成一种有效的血管张力调节物质——NO，该物质是目前已知的唯一血管舒张因子，其可介导血管舒张，还具有抑制平滑肌细胞增生、抗白细胞黏附及血小板聚集等功效〔4〕。血管内皮细胞损伤是糖尿病患者血管相关并发症的根本发病机制，血管内皮障碍也被临床确定为糖尿病相关并发症的早期征兆。糖尿病相关血管并发症患者及动脉粥样硬化患者其eNOS的NO合成水平均显著低于正常人群，因此，NO水平也成为临床衡量患者内皮功能损伤程度的重要标志物〔5〕。本研究也证实了上述结论。eNOS的活性可通过多个磷酸化反映位点调节，Ser-1177正是其中重要的一个位点〔6〕。高糖可导致Ser-1177磷酸化水平下降，进而导致NO合成水平下降，并阻断细胞己糖胺途径，进一步抑制eNOS活性。本研究表明高糖组和代谢记忆组内皮功能损伤更为严重。

MCP-1是趋化因子的一种，其可于动脉粥样硬化早期将单核细胞趋化至血管壁内;ICAM-1是具有较强的促单核细胞黏附血管内皮细胞作用的炎症因子〔7〕;IL-6是淋巴因子的一种，其具有增强细胞氧化应激压力，提高细胞通透性的功效，此外，IL-6还可抑制NO的血管扩张反应，导致患者内皮功能失调严重化〔8〕。本研究提示高糖组和代谢记忆组大鼠均存在较为明显的内皮功能异常症状，但控制血糖后内皮功能可有明显改善。早期的高血糖给内皮细胞造成了持久性的损伤“记忆”。

ROS是氧化应激重要参与物质之一，而氧化应激已被临床确定为糖尿病并发症重要形成机制，ROS可通过多途径参与糖尿病并发症的发生、发展，如激活蛋白激酶C，诱导晚期糖基化终末产物生产，激活氨基己糖通路等〔9〕。DHE和 CMH2DCFDA荧光强度是反映ROS表达水平的重要检测手段，其强度与ROS表达水平呈正相关〔10〕。

综上，早期高血糖对血管内皮细胞功能存在极大损伤，即使血糖水平恢复正常，其eNOS表达依然较高，即出现高血糖代谢记忆。

1 高 泓，谢春光，郭宝根，等．从伏邪理论对糖尿病大血管病变代谢记忆的理论探讨〔J〕．时珍国医国药，2013;24(9):2203-4．

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3 Sladden MJ，Sladden CS.Maximizing the quality of review articles〔J〕．Brit JDermatol，2007;157(2):409.

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5 Pirola L，Balcerczyk A，Okabe J，et al.Epigenetic phenomena linked to diabetic complications〔J〕．Nature Rev Endocrinol，2010;6(12):665-75.

6 刘 群，侯以琳，孙妍蕾．波动性高血糖、代谢记忆与糖尿病慢性并发症〔J〕．临床内科杂志，2014;31(10):714-5．

7 Cho YM，Kim TH，Lim S.Type2 diabetes-associated genetic variants discovered in the recent genome-wide association studies are related to gestational diabetes mellitus in the Korean population〔J〕．Diabetologia，2009;52(2):253-61.

8 谢满云，唐仕波．表观遗传调控在糖尿病视网膜病变中的研究进展〔J〕．中华眼底病杂志，2014;30(2):212-6．

9 王燕飞，侯 粲，苏 欣，等．组蛋白乙酰化与糖尿病〔J〕．中华内分泌代谢杂志，2014;30(2):167-70．

10 黄 焱，陈 婷，杜 涛，等．糖尿病大鼠晶状体高糖代谢记忆机制的研究〔J〕．中国实用眼科杂志，2014;32(3):375-8．