苗药九仙罗汉接骨汤干预对兔骨折模型的病理染色变化及血管内皮生长因子表达的作用

杨彦君 熊 屹 唐良华 易洪城 程志刚 敬 戈

(贵阳中医学院第二附属医院骨二科，贵州 贵阳 550003)

中医药治疗骨折具有减轻疼痛、消肿、缩短疗程、功能恢复好等特点。苗药九仙罗汉接骨汤由仙桃草、九节茶、地罗汉三味苗药组成，具有活血散瘀通络，接骨消肿止痛之功效〔1〕。本研究探讨苗药九仙罗汉接骨汤促进骨折愈合不同时相点的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 成年雌雄各半新西兰大耳白兔120只，体重为2.5～3.0 kg，由贵阳医学院动物实验中心提供。

1.2 实验药物 九仙罗汉接骨汤煎剂:由地罗汉、仙桃草、九节茶组成。按传统方法煎煮，制备所需浓度的煎剂，保存备用。三七粉:将三七粉溶于水后灭菌备用，含生药0.02 g/ml。

1.3 实验试剂 人抗兔血管内皮生长因子(VEGF)、即用型S-P免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);南美胎牛血清(贵阳爱瑞生物有限公司提供)。

1.4 造模 依据标准动物造模〔2〕。新西兰大白兔右胫骨前部中段用线锯造成宽3 mm深2 mm的骨缺损，深度达髓腔，生理盐水冲洗，青霉素16万U撒入创面预防感染，术毕缝合伤口，不予外固定。术毕分笼饲养，提供标准饲料，自由进食、水和自由活动。术后3 d每日早晚给予青霉素40万U肌注抗感染。

1.5 分组及给药 新西兰大白兔随机分为三组:接骨汤组，三七对照组，生理盐水组。①接骨汤组:灌胃给苗药九仙罗汉接骨汤煎剂(1 ml/kg)。②三七对照组:灌胃给同体积三七粉液(1 ml/kg)。③生理盐水组:灌胃给同体积生理盐水。所有动物于骨折当天开始给药，术后7、14、21、28 d分批处死，每组各10只。

1.6 动物取材和标本处理 给药试验后于7、14、21、28 d，各组动物按时间段在兔耳缘静脉空气注射处死动物，截取骨折中心上下各1 cm胫骨骨干，中性甲醛固定，用于HE及VEGF表达检测。

1.7 方法

1.7.1 HE染色检测 以骨缺损处为中心取长度约1 cm的胫骨骨干，将其置于40 g/L多聚甲醛溶液4℃下固定脱钙〔3〕。HE水洗，蓝化，中性树胶封固。切片后用200倍光学显微镜观察HE染色结果。

1.7.2 VEGF表达检测 采用武汉博士德生物有限公司生产的VEGF免疫组化，S-P试剂盒对标本VEGF的表达进行免疫组化检查。石蜡块作纵向间断连续切片(3μm)，脱蜡后经甲醇双氧水封闭内源性酶，南美胎牛血清封闭非特异性染色，ABC法检测骨痂组织中VEGF表达。使用即用型S-P免疫组化试剂盒，标本经一抗、二抗、ABC复合物处理，DAB显色后DPX封片，镜检，10×40倍显微镜下观察，呈棕色着色为VEGF阳性表达;每个标本再在10×10倍光镜下随机抽取3个视野作阳性表达计数，以3个视野计数均值作为各标本VEGF表达的计量指标。

1.8 统计学处理 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析及t检验。

2 结果

2.1 病理组织学检查 切片检查可见九仙罗汉接骨汤组两骨端生长新骨的时间较早，范围大，软骨内成骨过程较快，两端骨髓腔较早形成连接，28 d骨髓腔已完全贯通。三七对照组及生理盐水组两骨端出现新骨的时间较晚，软骨区范围较大，软骨内成骨过程时间长，骨痂生长相对缓慢，直到28 d两端骨髓腔未能连接。根据Lane-Sandhu〔4〕组织学评分法，对各组组织学光镜下所见进行组织学评分，见表1。

表1 Lane-Sandhu组织学检查评分(x±s)

2.2 骨痂VEGF免疫组织化学检测 各标本内均检测到VEGF阳性表达。①VEGF在生理盐水组中阳性表达于血管内皮细胞、骨细胞、骨膜血管内皮细胞，骨祖细胞及成软骨细胞，细胞数量少，骨祖细胞出现晚，未见骨小梁出现。②VEGF在三七对照组中阳性表达于血管内皮细胞、骨祖细胞及成软骨细胞，细胞数量较多，骨祖细胞出现较早，可见骨小梁出现，并见骨小梁周围有血管内皮细胞及骨细胞。③VEGF在接骨汤组中阳性表达于血管内皮细胞及成软骨细胞，细胞数量多，骨小梁较早出现，并见骨小梁排列致密，骨小梁周围有大量血管内皮细胞、骨细胞及成骨细胞。见图1。

图1 各组骨病VEGF的免疫组化检测(×400)

2.3 九仙罗汉接骨汤对VEGF表达的影响 接骨汤组与三七对照组中VEGF的MOD在骨折愈合21d时比较差异有统计学意义(P＜0.05);提示接骨汤组与三七对照组在治疗第14 d时促进VEGF的合成和分泌高于生理盐水组(P＜0.05)，两组中的VEGF的MOD升高贯穿于整个实验过程，并有促进骨细胞成熟，加速骨折愈合的过程，见表2。

表2 各组各时点VEGF平均光密度值(x±s，n=10)

3 讨论

骨折愈合是指骨折端之间再连接的修复过程可以重新形成与原骨的外形、结构及其功能一样的新骨〔5〕。骨再生是骨修复过程中的重要环节，任何形成的骨再生过程必须依赖于充足的血液供应〔6〕。

VEGF最重要的生物学活性就是特异地作用于内皮细胞，促其增殖和生长血管〔7〕。研究证实VEGF在骨形成和代谢中的作用主要是通过促血管生成参与骨发育形式〔8，9〕，VEGF可特异性作用于血管内皮细胞，最强的促血管生成因子〔10〕。促进其增殖和血管生成，决定血管形成的量与时间，并可增加血管通透性〔11〕。VEGF在骨折愈合初始期表达较弱，主要在骨细胞内;在血管生成和软骨形成期、软骨钙化期及软骨消散期，随着骨折的修复，肉芽组织长入血肿，软骨细胞及成骨细胞侵入发生软骨内骨化及膜内骨化，在这一阶段，组织修复耗氧，骨折局部低氧张力强烈诱导VEGF表达〔7〕。外源性VEGF作用下，局部血管形成增多，血流丰富，带来了大量促进骨折愈合的生物因子，促进骨折断端微血管新生增殖，使骨折断端血循环重建及成骨过程加快，从而加快了成骨速度，缩短骨折愈合时间。创伤骨折后折端VEGF表达贯穿于骨折愈合的全过程，骨折愈合的不同阶段，骨痂组织内出现程度不同的VEGF高表达，其表达规律与骨折端血管再生重建呈正相关〔12～14〕。

任何骨折靠其自身的机体免疫反应都会有自然愈合的倾向，但影响骨折愈合的因素众多〔15，16〕，适宜的药物干预能大大缩短骨折的愈合进程〔17〕。九仙罗汉接骨汤对骨折的愈合有良好的促进作用，促进骨痂生长，缩短骨折愈合时间。

1 杨彦君，唐良华，熊 屹，等.苗药九仙罗汉接骨汤促进胫骨干骨的折愈合〔J〕．中国组织工程研究，2012;11(46):8566-70.

2 柴本甫，汤雪明.实验性骨折愈合的超微结构研究〔J〕．中华外科杂志，1979;17(5):368.

3 马恒辉，章如松，周航波，等.介绍一种改良的Neutral EDTA脱钙液〔J〕．诊断病理学杂志，2005;12(5):391.

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6 刘东宁，刘广明，易伟宏，等.三七总甙对实验性骨折愈合过程中低氧诱导因子-Ia mRNA表达的影响〔J〕．中国伤残医学，2010;18(5):7-8.

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15 黄春梅，苏培基，李大刚.中药促进骨折愈合的临床研究文献的评价〔J〕．广西中医学院学报，2006;9(2):123-6.

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