大鼠海马认知障碍对糖脂代谢的影响及其与海马神经元凋亡的关系

杜 森 夏春波 叶 琳 莫文法 钟毓娟 莫 刚 王海侠

(桂林医学院人体解剖学教研室，广西 桂林 541004)

阿尔茨海默病(AD)和糖尿病(DM)是一组相互关联的复杂性疾病，有研究表明，60% ～70%的DM患者存在不同程度的认知功能障碍，主要表现为学习和记忆能力降低，其发生痴呆的危险性显著增加〔1，2〕，而高达81%的AD患者有不同程度的糖代谢异常〔3〕。本研究拟分析血糖血脂水平与大鼠海马脑区神经元凋亡的关系，为代谢异常的深入研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 Spraque-Dawley(SD)大鼠30只，雌雄不分，体重200～250 g，均由桂林医学院实验动物中心提供，合格证号:SCXK桂2007-000。水合氯醛购自国药集团化学试剂有限公司，Aβ1～42购自Sigma公司，微量注射器购自西化仪(北京)科技有限公司，血糖血脂检测试剂盒购自桂林优利特集团有限公司，全自动生化分析仪为德国Erba XL-600，凋亡检测试剂盒TUNEL(POD)(Roche USA)，二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 认知障碍大鼠模型的建立及实验分组 参照大鼠脑立体定位图谱，调整脑立体定位仪，大鼠经10%水合氯醛3 ml/kg腹腔麻醉，头部备皮后固定于脑立体定位仪上，沿头顶正中切开长约10～15 mm的纵形切口，分离骨膜，在海马上方用牙科钻钻开颅骨，实验组大鼠海马注射(前囟后3.8 mm，左旁开2.2 mm，进针2.9 mm)Aβ1～4215 μg，假手术组注射等体积磷酸盐缓冲液(PBS)，对照组未施加任何干扰因素。利用水迷宫实验检测大鼠认知能力，认知功能障碍判定标准:以大鼠从入水至爬上平台时间(定位航行)、跨越平台次数、在原平台象限时间百分比三项中的任意两项与对照组差异有统计学意义判定为认知功能障碍。

1.3 大鼠血糖血脂水平检测 造模后大鼠继续饲养45 d，经心脏采血后分离血浆，应用全自动生化分析仪检测大鼠空腹血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL)。

1.4 TUNEL法检测大鼠海马神经元凋亡 大鼠经10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔麻醉，心脏灌注固定，断头取脑，石蜡包埋切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，蛋白酶K 37℃孵育20～30 min，浸入3%过氧化氢溶液10 min，PBS洗3 min×3次，滴加50μl TUNEL反应混合液，在避光盒中37℃孵育1 h，PBS洗3 min×3 次，滴加 Converter-POD50 μl，37℃ 孵育 30 min，PBS 洗3 min×3次，DAB显色，中性树胶封片。以等量标记液(不含末端转移酶)代替TUNEL工作液做阴性对照。结果判定:以细胞核内出现棕黄色或黄色颗粒为阳性神经元，在显微镜下随机选择高倍视野进行凋亡神经元计数，凋亡指数=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.5 统计学方法 应用SPSS17.0软件，计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。

2 结果

2.1 认知障碍大鼠血糖血脂水平 大鼠饲养45 d后，表现为体重减轻，体型偏瘦，皮肤粗糙且黯淡无光，全自动生化分析仪检测结果显示，实验组大鼠FPG、TG、TC、LDL与假手术组和对照组比较均有显著性差异(P＜0.05)，HDL未见明显变化(P＞0.05)。见表1。

表1 认知障碍大鼠血糖血脂水平(x±s，mmol/L，n=10)

2.2 认知障碍大鼠海马神经元凋亡 凋亡神经元细胞核被染成棕黄色或黄色，染色深浅不一。实验组大鼠海马神经元凋亡指数为71.37%±3.15%，假手术组和对照组大鼠仅见有零星凋亡神经元，且染色较浅，凋亡指数分别为18.66%±3.20%、15.36%±4.25%，与实验组比较均有显著性差异(P＜0.05)。见图1。

图1 认知障碍大鼠海马CA1区TUNEL染色结果(×400)

3 讨论

AD和DM关系密切，两者不仅在认知功能和能量代谢等方面具有相似的临床表现，而且具有许多共同的病理生理基础，如胰岛素信号传导途径异常、糖基化终末产物(AGEs)增加、氧化应激、炎症反应等均可能参与疾病发生，但其具体发病机制尚未明确〔4〕。目前，许多学者〔5〕对DM引起AD进行了大量研究，但AD发病早期是否出现血糖血脂水平改变知之甚少，黄德弘等〔6〕对AD和血管性痴呆(VD)患者血糖、血脂及尿酸水平进行了研究，结果 AD和VD患者 FPG、TC、TG、LDL水平均显著升高，但HDL水平表现为明显降低，认为AD和VD患者均存在糖脂代谢紊乱，降脂降糖治疗可改善AD和VD临床症状。本实验研究结果显示高血糖高血脂大鼠海马结构发生了形态学改变，推测大鼠血糖血脂水平升高可能与海马神经元凋亡有关，提示AD可能是导致糖尿病糖脂代谢异常的重要因素之一。在解剖结构上，海马神经纤维联系广泛，它与下丘脑、杏仁核、脑干均有极其复杂的联系，下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(HPA轴)是神经内分泌途径的主要传出通路，中枢神经系统可以通过HPA轴来调节外周器官活动，刺激海马CA3区、齿状回和腹侧下脚可导致血浆皮质醇明显下降，损伤海马结构如腹侧下脚导致糖皮质激素分泌增加〔7〕。Forray等〔8〕认为，海马与下丘脑室旁核(PVN)之间存在直接的神经联系，也可通过前脑终纹床核(BNST)和其他下丘脑中继核团丰富的γ-氨基丁酸(GABA)能神经元影响PVN神经内分泌细胞活性，从而实现对HPA轴的调节。基于AD与DM的相似性，有学者认为，抑制海马神经元凋亡可能对DM脑病和AD的防治均有重要价值〔9，10〕。

1 Petrova M，Prokopenko S，Pronina E，et al．Diabetes type 2 hypertension and cognitive dysfunction in middle age women〔J〕．J Neurol Sci，2010;299(1-2):39-41.

2 Manschot SM，Brands AM，vander Grond J，et al．Brain magnetic resonance imaging correlates of impaired cognition in patients with type2 diabetes〔J〕．Diabetes，2006;55(4):1106-13.

3 Biessels GJ，Staekenborg S，Brunner E，et al．Risk of dementia in diabetes mellitus:a systematic review〔J〕．Lancet Neurol，2006;5(1):64-74.

4 Rao BS，Gupta KK，Karanam P，et al．Alzheimer disease:An interactome of many diseases〔J〕．Ann Indian Acad Neurol，2014;17(1):48-54.

5 赵咏梅，闫 颖，赵志炜.β淀粉样肽42及神经生长因子在实验性糖尿病脑病小鼠海马内表达的变化研究〔J〕．首都医科大学学报，2013;34(6):851-5.

6 黄德弘，刘孟渊.阿尔茨海默病和血管性痴呆患者血脂、血糖及尿酸水平的变化〔J〕．广东医学，2013;34(4):587-9.

7 Mueller NK，Dolgas CM，Herman JP.Stressor-selective role of the ventral subiculum in regulation of neuroendocrine stress responses〔J〕．Endocrinology，2004;145(8):3763-8.

8 Forray MI，Gysling K.Role of noradrenergic projections to the bed nucleus of the stria terminalis in the regulation of the hypothalamic-pituitaryadrenal axis〔J〕．Brain Res Rev，2004;7(1-3):145-60.

9 马楼艳，张栋珉，张 颖，等.Ghrelin对糖尿病大鼠海马神经元凋亡及其认知功能的影响〔J〕．基础医学与临床，2011;31(6):672-8.

10 Perez-Cruz C，Nolte MW，van Gaalen MM，et al．Reduced spine density in specific regions of CA1 pyramidal neurons in two transgenic mouse models of Alzheimer＇s disease〔J〕．J Neurosci，2011;31(10):3926-34.