小儿止泻巴布剂体外抑菌及皮肤刺激性试验

王京霞 陈 琳 高瑞兰

·论 著·

小儿止泻巴布剂体外抑菌及皮肤刺激性试验

王京霞 陈 琳 高瑞兰

目的 对小儿止泻巴布剂进行体外抑菌及皮肤刺激性试验，为其临床应用提供实验依据。方法 采用平皿法观察小儿止泻巴布剂浸膏对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢杆菌的抑菌效果从而确定最低抑菌浓度；应用新西兰兔完整皮肤及破损皮肤进行试验，考察小儿止泻巴布剂对新西兰兔皮肤刺激性反应。结果 小儿止泻巴布剂最低抑菌浓度（MIC）：金黄色葡萄球菌100mg/mL，大肠埃希菌400mg/mL，铜绿假单孢杆菌800mg/mL。新西兰兔完整皮肤组多次给药后两侧皮肤无红斑水肿，破损皮肤组出现轻度红斑及轻度水肿。结论 小儿止泻巴布剂有一定的抑菌作用，对新西兰兔完整皮肤无刺激性,对破损皮肤有轻度刺激性。

新西兰兔；小儿止泻巴布剂；体外抑菌；最低抑菌浓度；皮肤刺激性试验

小儿腹泻是一组由多病原、多因素引起的以大便次数增多和大便性状改变为特点的消化道综合征。小儿止泻巴布剂是在经典方药止泻散基础上研制而成，该散剂源于北宋中医儿科鼻祖钱乙创制的七味白术散，记载在《小儿药证直诀》中[1]，外敷脐部治疗小儿腹泻临床疗效好。在此基础上我们研制一种疗效确切、安全可靠、质量可控及使用方便的小儿止泻巴布剂。本文对小儿止泻巴布剂进行了体外抑菌及皮肤刺激性试验，为临床安全合理用药提供科学实验依据。

1 实验材料

1.1 动 物 健康雄性新西兰白兔，体质量1.9～2.2kg。浙江省实验动物质量合格证号：0009290，来源：浙江省新昌县大市聚镇欣健兔场[生产许可证号：SCXK（浙）2010-0042]。

1.2 主要药品及试剂 小儿止泻巴布剂浸膏（每mL含生药3.2g，批号：20131211）；小儿止泻巴布剂（规格：3cm×3cm，批号：20140131）；小儿止泻巴布剂空白对照（规格：3cm×3cm，批号：20140130）；以上试验样品由浙江省中医院制剂中心提供。营养肉汤培养基（批号：20130109-00）购自杭州微生物试剂有限公司。

1.3 菌 种 大肠埃希菌（escherichia coli）CMCC（B）44102，传代数：第3代，传代日期：20131115；金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus）CMCC（B）26003，传代数：第3代，传代日期：20131115；铜绿假单孢杆菌（pseudomonas aeruginosa）CMCC（B）10104传代数：第3代，传代日期：20131220；以上菌种均购自浙江省食品药品检验研究院。

1.4 主要仪器 FA-1104电子分析天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；JJ200/d=0.01g电子天平（常熟市双杰测试仪器厂）；SPX-150B-Z微电脑生化培养箱、MJX-160B-Z微电脑霉菌培养箱及SW-CJ-1BU单人水平洁净工作台（上海博迅实业有限公司）；YXQ.SG41.280手提式压力蒸汽灭菌器（上海华线医用核子仪器有限公司）。

2 实验方法

2.1 小儿止泻巴布剂体外抑菌试验

2.1.1 试验用菌液的制备[2]接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，30～35℃培养24h。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1mL含菌数为100cfu的菌悬液，备用。菌悬液在室温下放置2h内使用。

2.1.2 样品倍比稀释 按常规试管法，取小儿止泻巴布剂浸膏（含生药3.2g/mL），用营养肉汤作对比稀释（1600mg/mL、800mg/mL、400mg/mL、200mg/mL、100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL、12.5mg/mL），每管2mL，另留不含药液的肉汤作空白对照，高压灭菌后备用。

2.1.3 最小抑菌浓度（MIC）测定[3-4]取生长后的每种菌液用3～5mL 0.9%无菌氯化钠溶液校正浓度至0.5麦氏比浊标准，再用营养肉汤稀释1：10，稀释后的菌液尽快在30min内接种。用微量加样器每管加入0.1mL肉汤菌液，依次由低浓度到高浓度加入试管中，菌液与含药肉汤混匀后于37℃生化培养箱中培养24h，然后从每个药液稀释度的试管和对照试管中分别取一接种环接种在营养肉汤琼脂平皿上，放于培养箱中37℃培养24h，以不显示细菌生长的那一管的药液浓度作为最小抑菌浓度（MIC）。

2.2 皮肤刺激性试验[5-9]将16只新西兰兔平均分成4组：完整皮肤药物组、破损皮肤药物组、完整皮肤空白组和破损皮肤空白组。采用同体左右侧自身对比法，进行相同备皮面积的完整皮肤和破损皮肤局部刺激性试验。给药前将新西兰兔脊椎两侧对称部位去毛，去毛后24h检查去毛皮肤是否受伤，受伤的皮肤不能进行完整皮肤的刺激性试验。

破损皮肤组将脱毛部位用注射针头划“#”字并以出现渗血为度。左右两侧皮肤的破损程度基本一致。左侧贴小儿止泻巴布剂，右侧贴空白基质，将小儿止泻巴布剂用无刺激性的医用胶布固定，每天给药1次，每次给药时间相同，连续给药7天。给药期间及末次贴敷去除药物后1、24、48和72h在自然光线下肉眼观察皮肤反应并记录给药部位有无红斑和水肿情况，按照表1进行评分。皮肤刺激强度评价：0.00～0.49分，无刺激性；0.50～2.99分，轻度刺激性；3.00～5.99分，中度刺激性；6.00～8.00分，重度刺激性。

表1 皮肤刺激性反应及评分（分）

3 结 果

3.1 体外抑菌试验 小儿止泻巴布剂的最小抑菌浓度（MIC）：金黄色葡萄球菌为100mg/mL，大肠埃希菌为400mg/mL，铜绿假单孢杆菌为800mg/mL。见表2。

表2 小儿止泻巴布剂抑菌试验结果

3.2 皮肤刺激性试验 完整皮肤多次给药后新西兰兔皮肤刺激性反应平均分值均＜0.5分；破损皮肤药物组多次给药后皮肤刺激性反应最高分值为0.75分，破损皮肤空白组多次给药后皮肤刺激性反应最高分值为0.75分，反应强度均在0.50～2.99分之间。提示小儿止泻巴布剂对新西兰兔完整皮肤无刺激性，对破损皮肤有轻度刺激性，见表3。

表3 小儿止泻巴布剂皮肤刺激性评分（分）

4 讨论

小儿止泻巴布剂是在七味白术散基础上研制而成的小儿外敷巴布剂，用于小儿腹泻。据文献记载，七味白术散是对多种肠道疾病有很好疗效的经典方[10]，结合其外敷给药方式，我们选择了常用3种致病菌：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌，对小儿止泻巴布剂体外抑菌作用进行了研究，考察其对三种致病菌的抑菌效果。该制剂用于小儿，而小儿皮肤比较细嫩，根据“药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则[11]”中相关要求，我们选择新西兰兔对其进行了多次给药的皮肤刺激性试验。结果显示，小儿止泻巴布剂有一定的抑菌作用，对新西兰兔完整皮肤无刺激性，对破损皮肤有轻度刺激性。为临床前药物安全性评价提供实验数据。

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［11］药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则课题研究组.药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则［S］.北京：国家食品药品监督管理局，2014，5：63-65.

（收稿：2014-10-03 修回：2014-12-29）

Antibacterial Effect and Skin Irritation Reaction of Xiao'er Zhixie Cataplasm in vitro

WANG Jingxia,CHENLin,GAORuilan. PreparationCenter,theFirstHospitalaf filiatedtoZhejiangChineseMedicalUniversity, Hangzhou（310053）,China

Objective To investigate the antibacterial effect and skin irritation test of Xiao'er Zhixie cataplasm in vitro to provide experimental basis for its clinical application.M ethods Xiao'er Zhixie cataplasm was extracted by culture dish method and cocultured with Escherichia Coli,Staphylococcus Aureus,and Pseudomonas Aeruginosa to determine the minimum inhibitory concentrations（MICs）.New Zealand rabbits were divided into intact skin group and damaged skin group to test irritation reaction with Xiao'er Zhixie cataplasm.Results The MICs of Xiao'er Zhixie cataplasm on Escherichia Coli,Staphylococcus Aureus,and Pseudomonas Aeruginosa were 100,400,and 800 mg/mL,respectively.No erythema and edema was observed on both sides skin of New Zealand rabbits in the intact skin group after multiple dosing,while the damaged skin group appeared mild erythema and edema.Conclusion Xiao'er Zhixie cataplasm has some antibacterial effect,no irritation to rabbits'intact skin,and mild irritation to damaged skin.

New Zealand rabbits;Xiao'er Zhixie cataplasm;Bacteriostasis in vitro;Minimum inhibitory concentration;Skin irritation test

浙江省中医药科技计划项目（No.2014ZB030）

浙江省中医药大学附属第一医院制剂中心（杭州310053）通信作者：王京霞，E-mail：962039277@qq.com