荧光假单孢菌的研究和应用

王东凯，黄国庆，吴 琼，陈丽娟

(1.黑龙江省对俄工业技术合作中心，哈尔滨150090;2.黑龙江省科学院高技术研究院，哈尔滨150020)

荧光假单孢菌(Pseudomonas fluorescens)是菌根促生细菌的主要类群，具有拮抗多种植物病原真菌的能力。在不同土壤和不同植物类型菌根际微生物群落有很大差异。Cristiana等研究证明被灰白松露(Tuber borchii)侵染的欧洲栎(Quercus robur)菌根上多为荧光假单孢菌和皱纹假单孢菌(P.corrugata)，此类细菌具有促进菌根真菌孢子萌发和菌丝体生长的能力［1-3］。本项目是对从俄罗斯引进的菌根促生细菌与生物防治菌－荧光假单孢菌分离鉴定，发酵条件，菌剂制备和生物防治应用研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种:由俄罗斯科学院分子遗传研究所引进荧光假单孢菌菌剂。由黑龙江省科学院高研院微生物分子生物学试验室分离、纯化获得，为荧光假单孢菌ELS—1菌株，用KB培养液活化、培养。供试病原菌为油菜菌核病菌由国家南方农药创制中心提供，用PDA培养基培养。

1.1.2 滑石粉(药用滑石粉)等所用化学试剂均购于哈尔滨化学试剂公司。滑石粉载体材料经两次高压灭菌，每次121℃，处理30 min，烘干备用。

1.1.3 立式全温恒温振荡器IS－RDVI，哈尔滨东联电子仪器厂生产。30立升不锈钢发酵罐，BLBIO—30SJ型，上海百仑生物科技有限公司生产。高速冷冻离心机H2050R，湖南心湘仪生产。

1.2 方法

1.2.1 荧光假单孢菌菌株的分离纯化鉴定方法，参照文献进行［4-5］。分离出纯化的单菌落，在试管斜面培养，置4℃冰箱中保存备用。

1.2.2 发酵条件的选择，参照文献并略加修改进行［6-7］。

1.2.3 荧光假单孢菌菌悬液的制备方法，参照文献并略加修改进行［8-9］。发酵完成后，离心收集荧光假单孢菌ELS—1菌体，再用新鲜的KB液体培养基悬浮，使菌悬液中活菌数达到l×108个/mL。作为生防菌剂备用。

1.2.4 菌剂制备方法。参照文献进行［8］。滑石粉和羧甲基纤维素钠经121℃高压灭菌3次。每次灭菌30min，干燥后备用。前项所得到的菌悬浮，活菌数达到l×108个/mL以上。再加入少许2%的羧甲基纤维素钠溶液，充分混匀后，按比例与滑石粉混合(100︰24，m︰v)，室温放置48h后，装袋密封，室温贮藏。使用时，用平板计数法检测菌剂中活菌数，检测时重复3次。

1.2.5 菌剂中有效荧光假单孢菌ELS—1菌株菌体释放率的测定，参照文献进行［8］。

1.2.6 荧光假单孢菌ELS—1生防菌剂对油菜菌核病的防效试验方法，参照文献并略加修改进行［9－10］。

2 结果与分析

2.1 荧光假单孢菌的纯化鉴定和菌落特征

按照文献方法，在KB培养基上纯化鉴定出荧光假单孢菌，在紫外灯下检出产荧光的菌落，该菌在KB培养基上生长良好，如图1，菌落微隆起，淡黄色，边缘光滑，表面较湿润，可产生水溶性黄绿色色素，紫外光照射下有黄绿色荧光产生，如图2所示，革兰氏阴性，杆状，具极生鞭毛。

图1 KB培养基上的荧光假单孢菌菌株ELS—1菌落Fig.1 Colonies of Pseudomonas fluorescens on KB medium

2.2 荧光假单孢菌生理生化特性

图2 紫外光下荧光假单孢菌菌株ELS—1的荧光菌落Fig.2 Fluorescence colonies of ELS—1 under UV

筛选出的产荧光的细菌菌株ELS—1参照文献并略加修改进行［8］。进行生理生化鉴定，结果与标准荧光假单孢菌相同。特性是最适生长温度为28℃～30℃，低于4℃、高于41℃均不生长;产生荧光色素、不产生类胡萝卜素和脓青素;可以利用柠檬酸盐，对青霉素有抗性;氧化酶、接触酶和精氨酸双水解酶阳性，脂酶(Tween80)反应阴性;明胶液化、吲哚反应阳性，水解淀粉、反硝化、V—P反应阴性。定为荧光假单孢菌中的已知种。

2.3 筛选确定发酵条件及扩大培养和发酵生产荧光假单孢菌菌体

在摇瓶发酵所建立的发酵条件的基础上，对工业培养基进行30 L发酵罐的放大试验。由于发酵罐的搅拌和通氧条件均优于摇瓶发酵，因此菌体浓度和茵体形态都明显好于摇瓶发酵。由图3和镜检可知，接种O～4 h，菌数很少，pH值变化很小;4～24 h为对数生长期，菌体数量迅速增加，pH急剧下降;24～36 h对数生长结束，菌体进入稳定期，新陈代谢减慢，pH开始回升，杆状菌体大量脱落形成球状类芽孢菌体，28 h达到最大菌数178亿/mL，32 h 95%的菌体形成整齐的球状菌体，所以28～32 h为最佳放罐时间。然后进入衰亡期，菌数减少，pH值继续回升，48 h时pH值到达7.8。通过以上试验，确定了荧光假单孢菌(P.Fluorescen)BES—1菌体最佳发酵条件:温度为28℃，pH 为7.0，装液量为20 mL/250 mL三角瓶，200 r/min摇床振荡培养。通过对几种工业碳源和氮源的比较并在3个水平上进行正交试验，确定最佳培养基组成:可溶性淀粉10 g/L，豆饼粉15 g/L，葡萄糖 3 g/L，KH2P04 0.6 g/L，CaCO32 g/L。30 L发酵罐(装量20 L)扩大培养，可使最大发酵菌数达到1.78×1010/mL。试验中所确定的发酵培养基配方，其原料来源广泛，价格低廉，很适合农业上应用，为荧光假单孢菌的工业化生产提供了良好的条件。

2.4 载体滑石粉的用量对荧光假单孢菌ELS—1菌株吸附的效果

从图4可以看出，随着滑石粉用量的增加，Q也呈增长趋势，L呈下降趋势。当滑石粉用量从1 g/L增加到12/L时，Q值从2.19%增长到37.59%，此后增长缓慢;滑石粉用量从1 g/L增加到8 g/L，L值变化较大;从600 mg/g骤减到41.80 mg/g，随着滑石粉用量的继续增加，L值下降缓慢。当滑石粉用量为20g/L时，Q值为40.51%，L值为27.75 mg/g。

图3 发酵罐菌体生长的曲线Fig.3Growth curve of Pseudomonas fluorescens

图4 滑石粉的用量对吸附效果的影响Fig.4 Influence of talc powder dosage on the adsorption effect

结果表明，滑石粉对荧光假单孢菌ELS—1菌体的去除能力强，而负载能力略有减少。当载体用量为1 g/L时，负载能力有所增加。从整个吸附过程来看，滑石粉对荧光假单孢菌ELS—1菌株具有较好的吸附能力，用量的多少影响其对菌体的吸附效果。载体用量增多，可供菌体吸附的面积也相应增大，当菌体质量浓度一定时，单位质量的载体负载量下降。

2.5 菌剂中荧光假单孢菌ELS—1菌的活菌数

从表1可以看出荧光假单孢菌ELS—1菌体在两种菌剂中的存活数量随时间延长有明显差异。保存2d以滑石粉为载体的菌剂中菌体数目均保持在1011数量级。

表1 菌剂中荧光假单孢菌ELS—1的活菌数量Tab.1 The number of living Pseudomonas fluorescens ELS—1 in the dried powder agent

2.6 ELS—1活体菌剂对油菜菌核病的温室防治效果

温室试验结果，如表2所示，喷施荧光假单孢菌ELS—1菌剂50倍液和菌悬液均能有效控制油菜菌核病的发生(P＜0.05)，与不施用ELS—1菌剂和菌悬液而接种油菜菌核病病菌的对照相比，发病率分别下降了33.17%和16.17%。病指防效分别为87.85%和52.14%。二者存在极显著差异(P＜0.001)，这可能与载体包埋有关。载体包埋菌体后，对其具有一定的保护作用，有利维持活菌数，保证了菌体的抑菌活性。与空白对照相比，ELS—1菌剂和菌悬液对幼苗的根部有显著地促生作用(P＜0.05)，处理组的油菜根重较不施用任何菌剂的对照分别增长了65.72%和45.29%。但对叶片数的增加影响不大。温室试验结果也显示，采用菌饼接种法将油菜菌核病病菌接种到油菜叶柄基部的效果显著，油菜菌核病发病症状明显减少，且不污染土壤和周围植物，方法便利，可用于田间试验。

表2 荧光假单孢菌ELS—1菌剂对油菜菌核病的温室防治效果及幼苗生长的影响Tab.2 Influence of Sclerotinia sclerotiorum ELS—1 on greenhouse control effect and seedling growth

3 讨论

(1)荧光假单孢菌是一种常见的菌根促生细菌，其与菌根真菌有着密切的关系。1962年，Mosse就分离到AMF孢子促生菌(Pseudomonas sp)，并发现其有助于AMF侵染宿主。用电子显微镜检测发现AMF(Gigaspora margarita)的孢子和菌丝上粘附着荧光假单孢菌及根瘤菌。

本试验分离得到荧光假单孢菌(P.ftuorescens)ELS—1说明植物菌根上存在一定数量的菌根促生荧光假单孢菌。本研究还发现当 P.Fluorescens ELS—1菌液浓度为0.8×109～2.4×109cfu/mL时，可在一定程度上促进外生菌根真菌的生长，当P.fluorescens ELS—1菌液浓度大于2.4×109cfu/mL时，随着菌液浓度的增大，对外生菌根真菌的抑制越明显，这可能是菌根真菌与PGPR之间存在着对营养及生态位的竞争［10］，并可能产生10多种具有生防功能的次生代谢产物。

(2)发酵罐生产菌剂所使用的培养基的选择对于荧光假单孢菌菌剂推广应用极为重要，本研究确定最主要成分为可溶性淀粉10 g/L、依次是豆饼粉15 g/L、葡萄糖3 g/L、KH2P04 0.6 g/L。

(3)滑石粉作为吸附剂的研究和应用一直受到广泛关注，目前还未见有关滑石粉吸附菌体的报道，国外有学者将滑石粉用作微生物农药的主要添加剂［11］。本试验滑石粉吸附包埋菌剂中荧光假单孢菌ELS—1菌体，降低了外界不良因素对活菌体的损害，同时菌体吸附于载体上，具有一定的缓释效果，在贮藏期内菌体释放率较高，菌剂中活菌数保持在1010数量级，滑石粉均属于非金属矿产，资源丰富，开采成本低。本试验的吸附试验研究发现滑石粉对生防菌菌剂中荧光假单孢菌ELS—1菌株有较好的吸附效果，片层状的滑石粉为菌剂中荧光假单孢菌ELS—菌株提供了丰富的吸附位点。同时，这种材料的吸附作用属于物理吸附，因此吸附是一个快速的过程，在生产加工过程中能缩短用时，提高效率。当振荡溶解菌剂时，菌体也较容易从载体上释放出来。如果在农业防治上推广应用，不仅有助于滑石粉市场的进一步开拓，也对环境保护和生态维护起到不可估量的作用。本试验对菌剂载体材料的性质和菌剂的防效进行了初步研究，关于菌剂配方的优化、货架期的延长、田间防效的测定以及菌剂施用方式还有待深入研究。

［1］布坎南RE，吉本斯NE.中国科学院微生物研究所，译.伯杰细菌鉴定手册(第8版)［M］.北京:科学出版社，1984:287.

［2］杨光富，魏云林.假单孢菌研究现状及应用前景［J］.生物技术通报，2011，(1):37—40.

［3］年洪娟，张 杰，樊利强，等.ARDRA方法在荧光假单孢菌分离鉴定中的应用［J］.中国农业科学，2007，40(1):92 －98.

［4］杨毅，李治，高玲，等.荧光假单孢菌抗生性代谢产物合成相关基因的研究现状［J］.中国生物工程杂志，2012，32(8):100—106.

［5］窦燕峰，张根伟，尹秋响，等.荧光假单孢菌P S—1发酵条件的研究［J］.河北化工，2007，30(3)34—36.

［6］李慧，王平，肖明.硅藻土和滑石粉作为荧荧光假单孢菌PS—1发酵条件的研究［J］.中国生物防治，2009，25(3):23—24.

［7］王晓.荧光假单孢菌DH09生防菌剂的制备及其对油菜菌核病的防效研究［J］.中国植保导刊，2011，31(10):41—43.

［8］雷阳，曾延松，汪琳.荧光假单孢菌的生物防治机理［J］.贵州农业科学，2002，30(5):46—47.

［9］陈雪，赵克明.土传病害生物防治微生物的研究进展［J］.现代农业，2011，(7):34—35.

［10］荣良燕，姚拓，赵桂琴，等.产铁载体PGPR菌筛选及其对病原菌的拮抗作用［J］.植物保护，2011，3(1):59—64.

［11］Founoune H，Duponnois R，Ba AM，et a1.Mycorrhiza helper bacteria stimulate ectomycorrhizal symbiosis of Acacia holosericeawith Pisolithusalba［J］.NewPhytologist，2002，153(I):81—89.