血管性痴呆患者p38MAPK通路变化及参茸养心益肾胶囊干预作用

石海涛 张传领

血管性痴呆患者p38MAPK通路变化及参茸养心益肾胶囊干预作用

石海涛 张传领

目的 观察参茸养心益肾胶囊对血管性痴呆（AD）患者脑脊液和外周血p38MAPK通路主要因子P-p38MAPK/p38MAPK蛋白表达的影响。方法 血管性痴呆患者31例为病例组，给予参茸养心益肾胶囊治疗，对比治疗前后简易智能量表（MMSE）评分和长谷川痴呆量表（HDS）评分变化；治疗前后以Western blot检测患者脑脊液和空腹静脉血P-p38MAPK/p38MAPK蛋白表达量。以同期入院的26例非痴呆患者为对照组，进行对比分析。结果 病例组治疗前MMSE、HDS评分分别为（21.3±3.5）分、（19.6±3.4）分，治疗后分别上升至（28.2±4.8）分、（24.3±4.2）分，差异有统计学意义（P＜0.01）。治疗前病例组脑脊液、血P-p38MAPK/p38MAPK表达水平为（0.983±0.106）、（0.867± 0.113），明显高于对照组的（0.248±0.042）及（0.336±0.146）（P＜0.01）；治疗后病例组P-p38MAPK蛋白表达量明显降低，P-p38MAPK/p38MAPK表达水平显著低于治疗前（P＜0.05）。结论 参茸养心益肾胶囊可能通过抑制血管性痴呆患者p38MAPK磷酸化激活，干预p38MAPK信号通路级联反应而获得临床疗效。

血管性痴呆；p38MAPK通路；益肾活血；参茸养心益肾胶囊

血管性痴呆（vascular dementia，VD）泛指由脑血管因素而导致的脑组织损害和智能障碍，临床以记忆、认知、逻辑思维等精神功能衰退为主要表现，多发于老年人。研究[1-2]表明，内皮细胞损伤是血管性疾病的始动因素，而且其病理学机制贯穿于血管性疾病的发病全程。自p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinases，p38MAPK）通路与机体内皮系统损伤的关系被揭示以来，其生理学功能在VD发病过程中的介导作用受到重视。动物实验[3-4]也已经证实，VD大鼠、小鼠的海马p38MAPK蛋白表达水平明显上调，且其含量变化与模型鼠的记忆能力密切相关。本研究观察31例VD患者的脑脊液和外周血p38MAPK通路活化状态及中成药参茸养心益肾胶囊对该通路的调控作用，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2011年2月—2013年6月本院神经内科收治老年VD患者31例为病例组，男19例，女12例；年龄56～81岁，平均（71.3±6.3）岁；病程1～11年，平均（5.3±0.7）年。纳入标准：①符合田金洲2000版中医辨证量表诊断及辨证标准[5]；②同时符合NINDS-ADRDA诊断标准[6]；③MMSE＜27分。排除标准：①假性抑郁性痴呆或重度痴呆；②神经精神类疾病；③癫痫；④帕金森氏病；⑤肿瘤或癌症；⑥免疫、血液系统疾病；⑦机体重要器官器质性损伤等。另以同期收治的非痴呆患者26例为对照组，其中男15例，女11例；年龄55～78岁，平均（70.6±5.7）岁；慢性阻塞性肺病5例，高血压7例,冠心病14例。研究对象均签署知情同意书，研究经本院伦理委员会批准同意。

1.2 主要仪器和试剂 高速低温离心机（CTechcomp，T15RT）；蛋白印迹转移装置（SDS-PAGE TY0736，美国伯乐公司）；振荡培育箱（LRH-250-2，广东医疗器械厂）；预染蛋白marker（26681，Pierce）；Tween20（P9416，Sigma）；一抗Anti-phospho-p38 MAPK（pThr 179+Tyr181）antibody（SAB4504095，Sigma）；一抗Anti-p38 MAPK antibody（SAB4500493，Sigma）；一抗Anti-actin antibody（A2066，Sigma）；二抗Anti-Rabbit IgG-Tracy 645（05557，Sigma）；其他Western blot常规试剂如RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂盒、TEMED、ECL化学发光显色液等均由碧云天生物技术研究所提供。

1.3 研究方法 病例组入院后予参茸养心益肾胶囊（规格：0.4g/粒）1次4粒，1天3次。4周为1个疗程，共治疗2个疗程，于治疗前后取脑脊液和静脉血。对照组于入院时取脑脊液和外周血。所得脑脊液和静脉血以RIPA裂解液（含1.0%PMSF）抽提蛋白，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度。浓度确立后配置为1μg/ μL的buffer液。以10μL为上样量进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳条件：80V 25min，100V 80min，使不同分子量的蛋白条带分离。丽春红染液检测分离条带清晰、完整，转印至NC膜，转印条件：100V 1h。转印的NC膜先行一抗孵育，4℃震荡摇匀过夜，P-p38 MAPK、p38 MAPK、β-actin均溶于4%的脱脂牛奶，抗体浓度分别为1:2500、1:2000、1：3000。PBS液清洗3～5次，二抗孵育，抗体浓度均为1: 2000，28℃ 90min。二抗孵育完毕进行显影，显影条带扫描成像，以灰度分析软件分析灰度值，目的条带和β-actin比值为最终相对表达量。

1.4 观察指标 病例组治疗前后应用简易精神状态检查表（MMSE）、长谷川痴呆量表（HDS）进行评分[7]；两组P-p38MAPK/p38MAPK表达水平测定。

1.5 统计学方法 应用SPSS16.0统计软件，数据以均数±标准差（±s） 表示，治疗前组间对比采用两独立分组t检验，病例组治疗前后采用配对设计t检验；P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 治疗前后MMSE和HDS评分 病例组治疗后MMSE和HDS评分均有所提高，与治疗前比较差异有统计学意义（P＜0.01），见表1。

表1 VD患者治疗前后MMSE和HDS评分比较（分，±s）

表1 VD患者治疗前后MMSE和HDS评分比较（分，±s）

治疗前治疗后t，P 31 31 -21.3±3.5 28.2±4.8 6.221，0.000 19.6±3.4 24.3±4.2 4.652，0.000

2.2 两组P-p38MAPK/p38MAPK蛋白表达比较 治疗前，病例组外周血、脑脊液P-p38MAPK蛋白表达量偏高，P-p38MAPK/p38MAPK表达水平明显高于对照组（P＜0.01）；治疗后病例组外周血、脑脊液P-p38MAPK蛋白表达量明显降低，P-p38MAPK/ p38MAPK表达水平显著低于治疗前（P＜0.01）；见表2～3、图1。

3 讨论

VD的发病机制尚未完全明确，内皮系统损伤为其重要突破口之一。内皮细胞激活是发生内皮系统损伤的始动因素，炎症介质、应激刺激、病原体感染、细菌内毒素等病理因素均可构成其激活条件，激活后又可持续释放多种黏附分子、炎性介质及活性物质，诱发进一步的炎症反应和细胞凋亡[7]。p38MAPK信号通路由一组以级联方式依次活化的丝/苏氨酸蛋白激酶组成，MAPK激酶激酶、MAPK激酶及MAPK通过磷酸化依次将上游信号传递至下游应答分子，故而p38MAPK磷酸化为该通路活化的重要标志之一，即P-p38MAPK为p38MAPK的活化状态。刘倩等[8]对p38MAPK信号通路与内皮系统损伤的相关性做了阐述，指出p38MAPK通路活化是启动内皮系统损伤的先决条件，在血管性疾病中发挥了诱导、催化和促进级联化的病理功能。

表2 两组脑脊液P-p38MAPK/p38MAPK表达水平（±s）

表2 两组脑脊液P-p38MAPK/p38MAPK表达水平（±s）

注：“t1，P1”表示病例组治疗前与对照组比较，“t2，P2”表示病例组治疗前与治疗后比较

组别对照组病例组治疗前治疗后例数26 31 31 t1，P1t2，P2--P-p38MAPK 0.135±0.084 0.517±0.121 0.246±0.095 14.02，0.000 9.471，0.000 p38MAPK 0.543±0.102 0.526±0.084 0.534±0.093 0.678，0.250 0.338，0.368 P-p38MAPK/p38MAPK 0.248±0.042 0.983±0.106 0.461±0.063 35.47，0.000 23.02，0.000

表3 两组外周血P-p38MAPK/p38MAPK表达水平比较（±s）

表3 两组外周血P-p38MAPK/p38MAPK表达水平比较（±s）

注：“t1，P1”表示病例组治疗前与对照组比较，“t2，P2”表示病例组治疗前与治疗后比较

对照组病例组治疗前治疗后26 31 31 t1，P1t2，P2--0.203±0.146 0.465±0.187 0.312±0.162 6.639，0.000 4.543，0.000 0.554±0.281 0.536±0.275 0.549±0.277 0.243，0.404 0.177，0.430 0.336±0.146 0.867±0.113 0.568±0.185 11.12，0.000 5.672，0.000

图1 病例组P-p38MAPK、p38MAPK表达W estern blot显影图像注：①A脑脊液，B外周血；②1、2对照组脑脊液，3、4病例组治疗前脑脊液，5、6病例组治疗后脑脊液

中药治疗VD的临床疗效已被诸多实验证实[9-10]，本研究中所用参茸养心益肾胶囊药物组成为鹿茸、人参、酒制菟丝子、肉苁蓉、何首乌、桑葚及黄精等，药理研究[11-12]表明，鹿茸含有雄性激素、卵泡激素及多种微量元素，可改善能量代谢、促进生长发育，具有强筋骨、抗疲劳之效。适量的鹿茸还能够增加心输出量和血氧量、改善血液循环，同时提高副交感神经的兴奋性，促进受损神经功能恢复，是治疗血管性疾病的良品。人参性温，为中医常用补益药，具有扩血管作用，可改善微循环，调节中枢神经系统兴奋性，提高学习记忆能力。方中鹿茸、人参共为君药；菟丝子补肝肾、益精髓，肉苁蓉与何首乌补肾阳、益精血，共为臣药；桑葚既可入食，又可入药，可养心益智、补血活血，为佐药；黄精补气养阴，健脾润肺，为佐使；诸药合用，共司养血活血、益肾安心之效。本研究结果显示，治疗前病例组P-p38MAPK蛋白表达量偏高，P-p38MAPK/p38MAPK表达水平明显高于对照组；治疗后，病例组P-p38MAPK蛋白表达量明显降低，P-p38MAPK/p38MAPK表达水平显著低于治疗前，且病例组患者MMSE、HDS评分亦有显著提升，说明老年VD患者的p38MAPK通路确实处于异常活化状态，而益肾活血方药可抑制其活化，提高患者认知能力。

综上所述，老年VD的发病过程中伴随着p38 MAPK通路的活化，参茸养心益肾胶囊能够通过下调P-p38MAPK水平抑制其活化过程，从而中断p38MAPK信号通路级联反应，可能为其治疗VD的重要药理机制之一。

［1］Benisty S.Current concepts in vascular dementia［J］.Gériatrie Et Psychologie Neuropsychiatrie Du Vieillissement，2013，11（2）：171-180.

［2］Korczyn A，Vakhapova V，Grinberg L.Vascular dementia［J］. Journal of The Neurological Sciences，2012，322（1-2）：2-10.

［3］Yang S，Zhou G，Du Y，et al.Protective effects of p38 MAPK inhibitor SB202190 against hippocampal apoptosis and spatial learning and memory deficits in a ratmodel of vascular dementia［J］.Biomed Research International，2013，15（13）：215-212.

［4］Haddad J，Hanbali L.Hypoxia upregulates MAPK（p38）/ MAPK（ERK）phosphorylation in vitro:neuroimmunological differential time-dependent expression of MAPKs［J］.Protein And Peptide Letters，2014，21（5）：444-451.

［5］田金洲，韩明向，涂晋文，等.血管性痴呆的诊断、辨证及疗效判定标准［J］.北京中医药大学学报，2000，23（5）：16-24.

［6］徐俊，张颖冬.阿尔茨海默病新的NINCDS-ADRDA诊断标准介绍［J］.诊断学理论与实践，2009，8（4）：367-371.

［7］Dapper J，Crish S，Pang I，et al.Proximal inhibition of p38 MAPK stress signaling prevents distal axonopathy［J］.Neurobiology of Disease，2013，5（9）：26-37.

［8］刘倩，石颖，殷惠军.p38MAPK信号通路与内皮细胞激活［J］.中国分子心脏病学杂志，2011，11（5）：308-312.

［9］刘斌，毛文静，李爱春，等.参芎化瘀胶囊对血管性痴呆大鼠海马CA1区p38丝裂原活化蛋白激酶表达的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2010，16（8）：161-165.

［10］李敬会，蔡莉莉，李德梅，等.化痰祛瘀益智汤治疗老年血管性痴呆疗效观察［J］.四川中医，2013，31（9）：73-75.

［11］吴菲菲，金礼吉，李晓宇，等.鹿茸活性成分及其药理功能的研究进展［J］.黑龙江畜牧兽医，2012，33（3）：32-34.

［12］路放，杨世海，孟宪兰.人参药理作用研究新进展［J］.人参研究，2013，26（1）：46-52.

（收稿：2014-11-16 修回：2015-01-26）

p38MAPK Pathway Changes in Patients w ith Vascular Dementia and the Effect of Ginseng Nourishing the Heart and K idney CapsuleIntervention

SHI Haitao1,ZHANG Chuanling2. 1Department of Neurology,2Clinical Laboratory,Xiaoshan Hospital,Hangzhou(311201),China

Objective To investigate the effect of ginseng yangxin yishen capsule on P-p38MAPK/p38MAPK protein expression in cerebrospinal fluid and peripheral blood from patients with vascular dementia.M ethods Thirty-one patients with vascular dementia were recruited as case group and were given ginseng yangxin yishen capsules.Mino-mental State Examination（MMSE）and Hasegawa Dementia（HDS）scores were evaluated and compared before and after treatment.P-p38MAPK/p38MAPK protein expression in cerebrospinal fluid and peripheral blood were detected by Western blot.Twenty-six non-vascular dementia patients over the same period served as control.Results In case group,the MMSE and HDS scores increased to 28.2±4.82 and 24.3±4.19 from 21.3±3.54 and 19.6±3.44,respectively,both with significant difference before and after treatment（P＜0.05）.Before treatment, P-p38MAPK/p38MAPK protein expressions in cerebrospinal fluid and peripheral blood in case group were higher than those in control group（cerebrospinal:0.983±0.106 vs 0.248±0.042，P＜0.05;peripheral blood:0.867±0.113 vs 0.336±0.146,P＜0.05）;after treatment,the expression of P-p38MAPK protein and P-p38MAPK/p38MAPK level in case group significantly decreased compared with those before treatment（P＜0.05）.Conclusion Ginseng yangxin yisheng capsule may treat vascular dementia by interfering p38MAPK signal pathway via inhibiting activation of P-p38MAPK.

vascular dementia;p38MAPK signal pathway;yishen huoxue;Ginseng yangxin yisheng capsule

杭州市萧山医院神经内科（石海涛）、检验科（张传领）（杭州 311201）

石海涛，Tel：18967168116；E-mail：ll_141005@sina.com