五味子对雷公藤体外生物活性影响的实验研究

沈 炜屠 珏丁美红曹灵勇

五味子对雷公藤体外生物活性影响的实验研究

沈 炜1屠 珏2丁美红2曹灵勇2

目的 观察五味子与雷公藤配伍后对雷公藤体外生物活性的影响。方法 通过四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测雷公藤及雷公藤与五味子配伍后的水提液对小鼠脾淋巴细胞和L-02肝细胞增殖的影响。结果 雷公藤组0.6、3、15、75mg/mL浓度下对小鼠脾淋巴细胞增殖指数分别为（0.966±0.062）、（0.941±0.032）、（0.872±0.023）、（0.891±0.022），雷公藤加五味子组增殖指数分别为（0.900±0.053）、（0.940±0.081）、（0.963±0.015）、（0.973±0.039），两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。雷公藤加五味子组在四个实验浓度下对L-02人肝细胞增殖率分别为（24.885±7.722）%、（42.278±17.624）%、（84.709±18.941）%、（33.754±6.045）%，雷公藤组分别为-（62.092±7.840）%、-（68.555±0.788）%、-（65.577±0.755）%、-（67.829±5.495）%，两组各浓度L-02人肝细胞增殖率比较，P＜0.05。结论 五味子与雷公藤配伍后，在保持雷公藤体外免疫抑制活性的同时能有效降低雷公藤对肝细胞的毒性。

雷公藤；体外活性；五味子

雷公藤是临床常用于治疗免疫系统疾病的一味中药，性苦味寒，有大毒，归心、肝经。具有祛风除湿、活血通络、消肿止痛、杀虫解毒之功效。雷公藤免疫抑制活性十分显著，但其对肝、肾等组织的毒性[1-3]亦成为临床广泛运用的制肘。本文旨在“若有毒宜制，可用相畏相杀……”理论的指导下，借助体外细胞增殖抑制实验，研究五味子与雷公藤配伍后的体外生物活性。

1 实验材料

1.1 动 物 清洁级ICR小鼠10只，体质量18～22g，由浙江中医药大学动物中心提供，合格证编号：2008001642633。

1.2 药物及试剂 雷公藤饮片和五味子饮片购于浙江中医药大学中药饮片厂，经鉴定为合格饮片；刀豆素A、四噻唑蓝、二甲基亚砜均购自sigma公司；RPM I-1640培养基、DMEM培养基购自美国GIBCOBRL公司；胎生牛血清购自杭州四季青生物材料研究所。

2 实验方法

2.1 供试品溶液的制备 雷公藤水提液的制备：称取20g雷公藤饮片，加200mL水煎煮2h，滤过，滤渣加水200mL再煎煮1h，合并滤液，常压浓缩至每毫升含雷公藤生药材1g。临用时，用纯化水稀释至相应浓度，最终每毫升培养基中含雷公藤生药材0.6、3、15和75mg。

雷公藤五味子提取液的制备：称取20g雷公藤饮片，加入800mL水，煎煮1h后加入60g五味子，共煎1h，滤过，滤渣再加800mL水煎煮1h，滤过，合并滤液，常压浓缩至每毫升含雷公藤生药材1g。临用时，用纯化水稀释至相应浓度，最终每毫升培养基中含雷公藤生药材0.6、3、15和75mg。

2.2 淋巴细胞悬液的制备[4]取ICR小鼠，断椎处死后浸泡于75%酒精中消毒10min，于超净工作台上取脾脏，Hank’s培养液（37℃）冲洗后放置培养皿中，将脾脏细胞捻碎后过100目尼龙筛网，4℃，1500rpm离心10min，弃去上清液；沉淀重悬于5mL 0.83%Tri-NH4CL溶液中静置5min后加入含10%灭活胎牛血清的RPMI 1640培养液悬浮，4℃，1500rpm离心10min，洗涤3次弃去上清液，沉淀用10%灭活FBS的RPMI 1640培养液将细胞定容至1mL，混匀后取样细胞计数和细胞活力检测。

2.3 L-02人肝细胞悬液的制备[5]用含10%胎牛血清、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基将L-02人肝细胞于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中传代培养。取对数生长期细胞，经0.25%胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的PRMI 1640培养液配成单个细胞悬液备用。

2.4 MTT法检测水提物对小鼠脾淋巴细胞和L-02人肝细胞增殖的影响 在含培养基的96孔板中，每孔加入淋巴细胞混悬液100μL，conA50μL，分别加入不同浓度的雷公藤组、雷公藤加五味子组溶液50μL，空白对照组用RPMI 1640培养液，每组设6个复孔。37℃、5%CO2培养72h，1500rpm离心15min，弃去上清液，每孔加入MTT（2mg/mL）50μL，37℃，5% CO2培养4h。1500rpm离心10min，弃去上清液，每孔加入DMSO 150μL，待全部溶解后，选择570nm波长，用酶联免疫检测仪测定各孔吸光值。应用SPSS 17.0软件进行数据分析。

在含培养基的96孔板中，每孔加入L-02人肝细胞混悬液100μL和不同浓度的雷公藤组、雷公藤加五味子组溶液50μL，其余同小鼠脾淋巴细胞增殖检测方法进行操作。

3 实验结果

3.1 对小鼠脾淋巴细胞增殖作用影响 在雷公藤0.6、3、15、75mg/mL四个浓度下，两组间的增殖抑制作用比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

3.2 对L-02人肝细胞增殖作用影响 在0.6、3、15和75mg/mL四个浓度下，雷公藤组肝细胞大量死亡，雷公藤加五味子组四个浓度下对肝细胞的增殖均具有促进作用；两组L-02肝细胞增殖作用比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

4 讨论

雷公藤亲水性强的化学物质是临床上治疗类风湿性关节炎等免疫系统疾病常用的组分之一，本文通过小鼠脾淋巴细胞增殖实验，也发现雷公藤水提物对小鼠脾淋巴细胞增殖有很强的抑制作用，而雷公藤与五味子配伍后水提液体外免疫抑制活性与雷公藤单味药水提液的体外免疫抑制活性相当。可以推断五味子配伍雷公藤后对雷公藤具有免疫抑制活性的水溶性组分影响不大，但配伍后的物质组成有待进一步研究。

表1 两组小鼠脾淋巴细胞增殖指数比较（±s）

表1 两组小鼠脾淋巴细胞增殖指数比较（±s）

组别雷公藤组雷公藤加五味子组孔数6 6 0.6mg/mL 0.966±0.062 0.900±0.053 3mg/mL 0.941±0.032 0.940±0.081 15mg/mL 0.872±0.023 0.963±0.015 75mg/mL 0.891±0.022 0.973±0.039

表2 两组L-02肝脏细胞增殖作用比较（%，±s）

表2 两组L-02肝脏细胞增殖作用比较（%，±s）

注：与雷公藤组比较，△P＜0.05

组别雷公藤组雷公藤加五味子组孔数6 6 0.6mg/mL -62.092±7.840 24.885±7.722△3mg/mL -68.555±0.788 42.278±17.624△15mg/mL -65.577±0.755 84.709±18.941△75mg/mL -67.829±5.495 33.754±6.045△

通过L-02人干细胞的增殖试验，我们进一步验证了雷公藤对肝脏细胞的毒性，在四个实验浓度下，雷公藤水提物对L-02人肝细胞的增殖抑制率达到60%以上，且抑制率与雷公藤浓度之间的不存在“剂量-毒性”相关性。雷公藤与五味子配伍后，对L-02肝细胞的增殖有明显的促进作用，说明五味子能降低雷公藤对肝细胞的体外毒性。通过文献检索，发现五味子降低雷公藤肝细胞损伤可能的作用机制有以下几方面[6-9]：①可使肝细胞内糖元、葡萄糖-6-磷酸酶和乳酸脱氢酶含量增加，肝细胞琥珀酸脱氢酶和ATP酶活性增强。②通过抑制炎性渗出、减少肝细胞损伤降低血清肝酶。③通过抑制肝细胞内的细胞色素酶来抑制CYP活性发生改变。

本实验结果显示，雷公藤与五味子配伍后，仍然保持较强的体外免疫抑制活性，并且可以显著降低对L-02人肝细胞的毒性，为后续研究雷公藤配伍减毒增效实验提供了基础。

［1］ 向明，张程亮.雷公藤免疫抑制作用研究进展［J］.中草药，2005，36（3）：458-461.

［2］刘士敬，李建宇.浅谈雷公藤制剂对肝脏的损害［J］.中国中医药现代远程教育，2014，12（3）：104-106.

［3］焦云涛，高菁，任斌，等.中草药肾毒性及对策［J］.中国中西医结合肾病杂志，2014，15（1）：72-74.

［4］王彦，王长征.MTT法检测卵蛋白刺激哮喘小鼠脾淋巴细胞增殖最佳实验条件的研究［J］.毒理学杂志，2014，28（3）：170-173.

［5］黄柏英，余剑英，祝和成.人胚肝细胞分离培养研究［J］.湖南学院学报（自然科学版），2005，7（1）：10-12.

［6］杨春欣，马爱妞，董颖，等.雷公藤水溶性免疫抑制作用部位的筛选研究［J］.中国中西医结合急救杂志，2001，8（5）：268-230.

［7］汪丽亚，施九皋.景垂片对小白鼠四氯化碳性肝损伤保护作用的组织学和组织化学观察［J］.中西医结合杂志，1983，3（4）：237.

［8］胡宗礼，黄晓萍.虎杖方剂对四氯化碳致大鼠肝损伤的保护作用研究［J］.时珍国医国药，2009，20（3）：657-658.

［9］Iwata H，Twzuka Y，Kadota，et al.Inhibition of human liver microsomeal CYP3A4 and CYP2D6 by extracts from 26 herbalmedicines［J］.JTrad Med，2004，21（1）：42.

（收稿：2014-11-24 修回：2015-01-05）

In Vitro Biological Activities of Tripterygium w ilfordii Combined w ith Schisandra chinensis

SHEN Wei1,TU Jue2,DING Meihong2,CAO Lingyong2. 1Preperation Center,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Traditional Medical University,Hangzhou(310000),China;2Zhejiang Traditional Medical University,Hangzhou(310053),China

Objective To investigate the combination of Schisandra chinensis with Tripterygium wilfordii on in vitro biological activities of the latter.M ethods Four p-methyl-tetrazolium（MTT）assay was used to detect the proliferation of mouse spleen lymphocytes and human L-02 liver cells treated with extracts from Tripterygium wilfordii alone or combination of Tripterygium wilfordii and Schisandra chinensis.Results The proliferation of mouse spleen lymphocytes in Tripterygium wilfordii alone group was 0.891±0.022,0.941±0.032,0.966±0.062,and 0.966± 0.062 with dose of 0.6,3,15,75mg/mL and that in Tripterygium wilfordii combined with Schisandra chinensis group was 0.900±0.053,0.940±0.081,0.963±0.015,and 0.973±0.039,with no difference between the two groups（P＞0.05）.The proliferation rate of human L-02 liver cells in combination group with four different concentrations of Tripterygium wilfordii was（24.885±7.722）%,（42.278±17.624）%,（84.709±18.941）%,（33.754±6.045）%,which was higher than that of Tripterygium wilfordii alone group[（-62.092±7.840）%,（-68.555±0.788）%,（-65.577±0.755）,（67.829±5.495）%,P＜0.05].Conclusion Tripterygium wilfordii combined with Schisandra chinensis can hold the immunological activity of Tripterygium wilfordii in vitro while can effectively reduce the toxicity of Tripterygium wilfordii on liver cells.

mice;MTT;Schisandra chinensis;Tripterygium wilfordii;Compatibility

浙江省科技厅2012年度第二批省级重点科技创新团队项目（No.2009R50042-11）

1浙江中医药大学附属第一医院制剂中心（杭州310000）；

2浙江中医药大学（杭州310053）

曹灵勇，Tel：13588360581；E-mail：caolingyong@163.com