骶3神经电调节对脊髓损伤早期大鼠逼尿肌细胞凋亡及膀胱纤维化影响的实验研究

宋 晨诸靖宇吴金星徐智慧张大宏

骶3神经电调节对脊髓损伤早期大鼠逼尿肌细胞凋亡及膀胱纤维化影响的实验研究

宋 晨1诸靖宇1吴金星1徐智慧2张大宏2

目的 观察骶3神经电调节对脊髓损伤早期大鼠逼尿肌细胞凋亡及膀胱纤维化影响。方法 取雌性成年SD大鼠90只，随机分成实验组60只，空白对照组30只，采用脊髓横断法建立大鼠神经源性膀胱的模型。实验组大鼠随机分为电针组及阴性对照组，各30只。电针组进行电极植入，并行电调节治疗2周。3组大鼠2周后同时处死取材，均分别采用胶原染色、苦杏酸天狼星红染色、免疫组化方法来观察逼尿肌纤维化程度。采用透射电镜观察逼尿肌细胞超微结构改变。结果①胶原染色及苦杏酸天狼星红染色观察，电针组同阴性对照组相比，平滑肌细胞之间胶原纤维的数量明显减少，细胞排列规则。②电针组膀胱组织CollagenⅠ和CollagenⅢ表达分别为（1.042± 0.213）、（1.532±0.141），均明显低于阴性对照组的（2.049±0.246）、（3.901±0.208），电针组Ⅰ/Ⅲ型胶原比例较阴性对照组明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。阴性对照组CollagenⅠ和CollagenⅢ表达显著高于空白对照组的（1.154±0.124）、（0.780±0.127），阴性对照组Ⅰ/Ⅲ型胶原比例较空白对照组明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。③电镜观察，电针组与阴性对照组相比，逼尿肌细胞表面平滑，排列均匀，胞浆内线粒体结构完整，无肿胀破裂现象，细胞结构接近于空白对照组。结论骶3神经电调节能抑制脊髓损伤早期大鼠膀胱逼尿肌间质中胶原纤维的表达，减少脊髓损伤后大鼠逼尿肌细胞的凋亡，促进膀胱功能恢复。

大鼠；脊髓损伤；骶3神经电调节；逼尿肌细胞凋亡；膀胱纤维化

图1 各组大鼠膀胱逼尿肌纤维化程度比较（胶原VG染色 ×400）注：a、b、c分别为空白对照组、阴性对照组、电针组大鼠膀胱逼尿肌细胞通过VG染色观察到的纤维化程度

图2 各组大鼠膀胱逼尿肌纤维化程度的比较（苦杏酸天狼星红染色，×400）注：a、b、c分别为空白对照组、阴性对照组、电针组大鼠膀胱逼尿肌细胞通过苦杏酸天狼星红染色观察到的纤维化程度

图3 各组大鼠膀胱组织中CollagenⅠ和CollagenⅢ的表达（免疫组化染色，×400）注：a、b、c分别为空白对照组、阴性对照组、电针组大鼠膀胱组织中CollagenⅠ的表达情况（阳性表达呈棕黄色，阴性对照组高表达）；d、e、f分别为空白对照组、阴性对照组、电针组大鼠膀胱组织中CollagenⅢ的表达情况（阳性表达呈棕黄色，阴性对照组高表达）

图4 各组大鼠膀胱逼尿肌电镜下超微结构表现（×24 000）注：a为空白对照组，b为阴性对照组，c为电针组

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是导致患者出现严重排尿障碍、上尿路损害以致肾功能衰竭的病因之一[1]。脊髓损伤后神经源性膀胱早期阶段因缺乏神经刺激导致逼尿肌凋亡，逼尿肌中胶原纤维的增加导致膀胱顺应性下降[2]，继而出现膀胱纤维化、储尿及排尿功能障碍。动物实验发现，电针关元穴可以缓解脊髓损伤后膀胱逼尿肌细胞凋亡[3]。本实验通过完全脊髓损伤大鼠模型，观察电调节骶3神经对大鼠膀胱逼尿肌超微结构的改变及逼尿肌纤维化程度的影响，以期探讨脊髓损伤后神经源膀胱早期骶神经电调节疗效的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 健康成年雌性SD大鼠90只购自上海斯莱克，合格证号：SCXK（沪）：2012-002。根据完全随机实验设计，将90只大鼠随机编号，取数，排序，分成实验组60只，空白对照组30只，采用脊髓横断法建立大鼠神经源性膀胱的模型。实验组大鼠中随机分为电针组及阴性对照组。即进入正式试验的大鼠样本为每组30只。

1.2 动物模型制作[4]腹腔注射戊巴比妥钠（25～30mg/kg）麻醉大鼠，需要手术的两组大鼠经背部纵行切口，然后在脊髓T9节段行全横断术，并切除其上4mm脊髓组织，清除损伤腔内残留的神经组织，在缺损腔内植入骨腊作为填充物。逐层缝合切口。造模成功标准：切除脊髓时尾巴痉挛性摆动，双后肢拖地爬行。大鼠脊髓损伤后立即处于脊髓休克期，部分在耻骨联合上缘可触及胀大的膀胱。初期采用腹部按压方式辅助排尿。

1.3 新型针式电极植入[5]及骶3神经电调节方法 缝合皮肤即刻，电针组大鼠开始植入针式电极。平第3骶椎棘突，用带电刺激穿刺针以75度角向内斜刺20mm。术后前5天每天对造模成功大鼠按压下腹部膀胱区辅助排尿3次，每只大鼠均单笼饲养。术后腹腔注射青霉素（每天50 000U/kg，连续3天）。将电针组大鼠用装置固定，背部外露，将电极线连接穴位电针仪，予连接肌电刺激仪，用频率3～5Hz的连续波，强度3～5V电刺激，以大鼠骶部和/或尾部颤动而不致全身颤动的表现为宜；每次电调节30min，每天1次，共2周。

1.4 取材时间及方法 待电针组电针治疗2周后，同时处死3组大鼠，3组大鼠膀胱组织均分别应用胶原（VG）染色、苦杏酸天狼星红染色、免疫组化方法，观察逼尿肌纤维化程度（胶原纤维含量、Ⅰ/Ⅲ型胶原比例）；用透射电镜观察逼尿肌细胞超微结构。

1.5 检测方法

1.5.1 胶原（VG）染色及苦杏酸天狼星红染色观察逼尿肌纤维化程度 厚度为4μm的切片予二甲苯脱蜡15min，梯度酒精复水，分别用VG染液及0.1%饱和苦味酸-天狼星红溶液染色。

1.5.2 免疫组化法检测大鼠膀胱组织CollagenⅠ和CollagenⅢ的表达 阳性反应：细胞浆呈棕黄色为阳性表达。染色结果采用半定量分析方法：评分以染色强度结合阳性细胞数百分比进行乘积。染色强度以多数细胞呈现的染色强度并减去背景着色计分：无明显着色为0分，淡黄色或轻微黄色为1分，深黄或棕黄色为2分，棕褐色或黑褐色为3分。阳性细胞百分比即每张免疫组化切片选择5个不同的视野（× 400）观察，每个视野计数100个细胞中阳性细胞数，计算阳性细胞平均数：≤5%评0分，6%～25%评1分，26%～50%评2分，51%～75%评3分，＞75%评4分。

1.5.3 透射电镜观察超微结构 取大鼠膀胱肌肉组织，标本修剪成约1mm×1mm×1mm大小的膀胱逼尿肌组织块，置于2.5%戊二醛溶液低温固定，包埋、切片、锇酸染色定位后超微切片（120nm），透射电镜（× 24 000）观察逼尿肌组织超微结构改变。

1.6 统计学方法 建立Excel数据库，应用SPSS 17.0统计软件进行统计分析。计量数据以（±s） 表示，均为正态资料。组间整体分析为单因素方差分析，两两比较为LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 大鼠造模后，共死亡5只，即有55只造模成功，确保了阴性对照组和电针组样本量均大于25只。造模成功大鼠均存活良好，有明显的后肢运动功能障碍，证实为成功的脊髓损伤模型。

2.2 各组大鼠膀胱逼尿肌纤维化程度比较

2.2.1 胶原VG染色观察比较 空白对照组平滑肌细胞之间有胶原纤维和肌纤维存在，见图1a（插页）。阴性对照组平滑肌细胞之间胶原纤维较空白对照组大量增多，肌纤维明显减少，见图1b（插页）。电针组平滑肌细胞之间的胶原纤维较阴性对照组明显减少，细胞排列较规则，见图1c（插页）。

2.2.2 苦杏酸天狼星红染色观察比较 空白对照组平滑肌细胞之间Ⅰ型胶原近似平行排列，密度均一；Ⅲ型胶原分布于Ⅰ型胶原周围，见图2a（插页）。阴性对照组平滑肌细胞之间Ⅰ型胶原纵横交错，排列紊乱，密度分布不均；Ⅲ型胶原比例较空白对照组增加，Ⅲ型胶原呈疏网状散布于Ⅰ型胶原周围，见图2b（插页）。电针组平滑肌细胞之间Ⅰ/Ⅲ型胶原比例较阴性对照组明显减少，细胞排列规则，见图2c（插页）。

2.3 各组大鼠膀胱组织CollagenⅠ和CollagenⅢ表达 显微镜下观察，CollagenⅠ和CollagenⅢ阳性表达呈棕黄色，每张免疫组化切片选择5个不同的视野（×400）观察，并判读阳性表达强度和阳性率。对每个视野均进行染色强度计分与阳性细胞百分比乘积评分，评分以阳性细胞百分比与染色强度的乘积：0分为阴性（-），1～6分为弱阳性，7～12分为强阳性。评分结果见表1。

对表1资料进行整体分析（单因素分析），两个指标的3个组间整体比较均有统计学意义（P＜0.05）。阴性对照组CollagenⅠ和CollagenⅢ表达显著高于空白对照组（P均＜0.05），阴性对照组Ⅰ/Ⅲ型胶原比例较空白对照组和电针组明显增高，差异有统计学意义（P均＜0.05）。电针组CollagenⅠ和CollagenⅢ的表达及Ⅰ/Ⅲ型胶原比例与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1和图3（插页）。

表1 各组大鼠膀胱组织CollagenⅠ和CollagenⅢ表达（±s）

表1 各组大鼠膀胱组织CollagenⅠ和CollagenⅢ表达（±s）

注：与阴性对照组比较，▲P＜0.05；与空白对照组比较，△P＜0.05

组别阴性对照组空白对照组电针组只数26 30 29 F P CollagenⅠ表达2.049±0.246△1.154±0.124 1.042±0.213▲113.347＜0.05 CollagenⅢ表达3.901±0.208△0.780±0.127 1.532±0.141▲1,531.591＜0.05

2.4 各组大鼠膀胱逼尿肌超微结构比较 电镜观察，空白对照组大鼠膀胱逼尿肌肌细胞分布均匀，走行整齐，细胞胞核形状规则，胞浆内少量线粒体出现轻微水肿现象，见图4a（插页）。阴性对照组较空白对照组逼尿肌细胞间间距变宽，外形、大小不一致，分布不均匀，排列走行紊乱，有大量凹陷，胞浆内线粒体肿胀破裂呈空泡状，见图4b（插页）。电针组较阴性对照组逼尿肌细胞表面平滑，排列均匀，胞浆内有少量线粒体，且结构较完整，部分肿胀破裂现象，细胞结构接近于空白对照组，见图4c（插页）。

3 讨论

神经源性膀胱的一个显著病理特征是逼尿肌纤维化，即肌束间大量胶原纤维沉积，是导致膀胱顺应性下降，逼尿肌挛缩或收缩无力的主要原因[6]，因而出现膀胱贮存和排空障碍。逼尿肌萎缩与纤维化易导致膀胱高压储尿，进而引起上尿路损害，导致肾功能衰竭等严重并发症，因此危害尤甚[7]。胶原纤维是细胞外基质的主要成分，膀胱壁的胶原纤维主要为Ⅰ型和Ⅲ型，Ⅲ型胶原是膀胱顺应性的决定因素，其含量增加将会导致膀胱壁弹性的丧失[8]和平滑肌功能的减退，从而导致膀胱挛缩、膀胱高压。Deveaud等[9]研究发现，在低顺应性膀胱组织中总的胶原含量仅增加10%，而Ⅲ型胶原的含量却增加49%。本次实验也发现，阴性对照组大鼠膀胱逼尿肌中Ⅰ型、Ⅲ型胶原纤维含量均明显增加，但Ⅲ型胶原纤维含量增高更为显著（P＜0.05）。

脊髓损伤后功能恢复是临床治疗领域的难题之一；神经系统损伤后难以恢复，并且影响神经所支配的效应器官，如膀胱逼尿肌、膀胱感觉等[10]。神经电刺激和调节是神经源性膀胱治疗的新亮点，国内有学者通过骶3神经电针脊髓损伤患者来改善排尿、预防尿路感染等并发症，取得明显疗效[11]。孙岚等[12]动物实验发现，电针调节对逼尿肌反射亢进有平衡作用，可抑制逼尿肌的过度收缩，改善膀胱顺应性，并能改善膀胱组织的病理变化。电针调节既具有改善膀胱、尿道括约肌等骶神经支配的效应器官功能，也能促进骶髓排尿中枢恢复[13]。

目前脊髓损伤后神经源性膀胱的后期治疗尚未取得突破性进展，有必要探索在脊髓损伤的早期阶段进行积极治疗的可能性。前期动物实验已经发现，电针调节明显促进脊髓损伤早期膀胱尿道功能恢复，抑制逼尿肌过度收缩，缓解尿道括约肌痉挛，能改善膀胱容量[5]。本实验采用骶3神经通路对脊髓损伤早期膀胱进行弱电刺激，结果提示电针组大鼠膀胱Ⅲ型胶原纤维含量显著低于阴性对照组；透射电镜发现电针组逼尿肌细胞胞浆内线粒体破裂程度轻微，超微结构的病理状态得到改善。

综上所述，骶3神经电调节可以减少脊髓损伤早期膀胱逼尿肌细胞凋亡，抑制逼尿肌纤维化进程，促进脊髓损伤后膀胱逼尿肌功能恢复，改善膀胱顺应性。对于神经电调节是否促进骶髓排尿中枢恢复，有待于进一步实验研究证实。电调节骶3神经对脊髓损伤后神经源性膀胱早期康复的机制研究具有积极意义。

［1］Cortez R，Levi AD．Acute spinal cord injury［J］．Curt Treat Options Neurol，2007，9：115-125．

［2］孙小兵，李金良，陈雨历.等.TGF-β1与神经源性膀胱逼尿肌纤维化［J］.中华小儿外科杂志，2002，23（6）：502-504.

［3］王俊华，陈邦国，尹晶.等.电针不同穴位对脊髓损伤后尿潴留大鼠逼尿肌细胞凋亡的影响［J］.中华物理医学与康复杂志，2009，31（6）：380-384.

［4］David BT，Steward O.Deficits in bladder function following spinal cord injury vary depending on the level of the injury［J］.Exp Neurol，2010，226（1）：128-135.

［5］徐智慧，王彦彬，诸靖宇.等.早期骶3神经电调节在脊髓损伤后神经源性膀胱治疗中的应用及作用机制分析［J］.浙江医学杂志，2013，35（24）：2158-2160.

［6］Deveaud C，Macarak E，Kucich U，et al.Molecular analysis of collagens in bladder fibrosis［J］.JUrol，1998，160：1518-1527.

［7］徐智慧，王彦彬，诸靖宇.等.骶3神经电针治疗逼尿肌无力症的临床研究［J］.中国康复理论与实践，2010，16（11）：1053-1055.

［8］Cortivo R，Pagano F，Passerini G，et al．Elastin and collagen in the normal and obstructed urinary bladed［J］.Brit J Ur01，1981，53：134-137.

［9］Deveaud C，Macarak E，Kucich U，et al.Molecular analysis of collagens on bladder in bladder fibrosis［J］．JUrol，1998，160：1518-1527.

［10］丛惠伶，廖利民，司同，等．电针调节骶3神经治疗神经源性逼尿肌过度活动的效果研究［J］.中华泌尿外科杂志，2010，31（11）：741-744.

［11］徐智慧，王彦彬，诸靖宇.等.骶3神经电针预防脊髓损伤后尿路感染的临床研究［J］.中华医院感染学杂志，2013，23（6）：1359-1360.

［12］孙岚，李建军，王征美.电针对脊髓损伤患者膀胱功能影响的尿动力学分析［J］.中国康复理论与实践，2005，11（11）：903－904.

［13］卫中庆.骶神经刺激/调节在下尿路功能障碍的应用［J］.临床外科杂志，2010，18（11）：723-724.

（收稿：2014-08-20 修回：2014-12-23）

Effect of Sacral Neuromodulation Via S3 Foramen on the Apotosis of Detrusor Cells and Fibrosis of theBladder in Spinal Injured Rats

SONG Chen1,ZHU Jingyu1,WU Jinxing1,XU Zhihui2,ZHANG Dahong2.1Department of Urology,the Third People's Hospital of Hangzhou,Hangzhou (310009),China;2Department of Urology, Zhejiang Provincial People's Hospital,Hangzhou(310014),China

Objective To investigate sacral nerve stimulation through S3 foramen for the treatment of detrusor cell apoptosis and neurogenic fibrosis of the bladder in rats with spinal cord injury（SCI）.M ethods Ninety SD female rats were randomly divided into experimental group（n＝30）,control group（n＝30）,blank group（n＝30）.SCI model was established by crosscutting spine.Rats in experimental group were implanted with electrical acupuncture poles and had neruomodulation for 2 weeks.Rats in 3 groups were all sacrificed at the end of nerve stimulation and immunohistochemistry,collagen staining and Sirius Red F3B（SR）staining and transmission electron microscope（TEM）were used to observe the apoptosis and fibrosis of the detrusor muscle.Results Collagen and SR staining showed that less collagen fiber was seen between detrusor cells and the cells were more regular and smooth in experimental group than those in control group.Collagen I and collagen III were decreased in experimental group than those in control group（collagen I:1.042±0.213 vs 2.049±0.246,collagen III:1.532±0.141 vs 3.901±0.208,P＜0.05）.The ratio of collagen I to collagen III in experimental group was lower than that in control group with significant difference（P＜0.05）.The collagen I and collagen III of control group was higher than that of blank group（collagen I:1.154±0.124,collagen III:0.780±0.127,P＜0.05）and the ratio of collagen I to collagen III was also higher（P＜0.05）.TEM observed that the cells of experimental group were more regular and smoother than those ofcontrol group and no cell edema and destroied and the construction of the cells were similar to the normal cells（blank group）.Conclusion The S3 nerve electrical stimulation may improve bladder function by inhibiting apoptosis and fibrosis of detrusor cells in SCI rats.

rats;spinal cord injury;S3 neuromodulation;detrusor cell apoptosis;bladder fibrosis

杭州市科技计划项目（No.20110833B15）；浙江省医药卫生科技计划项目（No.2011KYB070）

1杭州市第三人民医院泌尿外科（杭州 310009）；2浙江省人民医院泌尿外科（杭州 310014）

徐智慧，Tel：13757179772；E-mail：jhtotal@163.com