GC/MS指纹图谱结合Hotelling T 2检验用于香精品质控制

刘秀明，王家俊，李源栋，夏建军，田润涛，者 为*

1.云南中烟工业有限责任公司技术中心，昆明市北市区红锦路367号 650231

2.科迈恩（北京）科技有限公司，北京海淀区信息路26号中关村创业大厦400室 100080

烟用香精主要用于增进卷烟嗅香和抽吸风味等，由于其化学成分复杂，对其中一种或几种化学成分进行定性定量分析，难以有效地控制其品质［1］。目前，用于分析香精香料的仪器主要有近红外光谱仪［2］、高效液相色谱仪（HPLC）［3］、气相色谱-质谱联用仪（GC/MS）［4］等。由于香精一般均为挥发性和半挥发性成分，GC/MS分析法较为广泛采用。色谱指纹图谱的应用是一种有效的品质控制方法，但在分析中，无论采用相关系数还是矢量夹角余弦来计算相似度，由于算法本身的问题，其对数据变化不敏感［5］，并且采用单一的某个方法很难对指纹图谱提取物的成分及质量分数进行总体评价；若采用化学计量学的方法，可对其品质稳定性进行适当评价。主成分分析（Principal component analysis，PCA）是通过对一组相关变量进行正交旋转等处理，用维数较少的互不相关的新变量来反映原变量提供的大部分信息，通过分析新变量达到解决问题的一种多元统计方法，已经应用在许多领域［6-10］。在香精香料品质控制方面，文献［8-9］采用GC/MS及PCA法分别建立了咖啡香精和烟用香精的指纹图谱，进行品质控制。Hotelling T2检验是一种常用多变量检验方法，是单变量检验的自然推广，常用于两组均向量的比较［11］。因此，将181个烟用香精样品直接稀释进样，采集各个样品的GC/MS指纹图谱，采用PCA分析方法建立3类香精的分类模型，并设置95%置信限为控制线，99%置信限为预警线，提取3类香精的Hotelling T2统计量，实现对香精品质的稳定监控，为香精品质控制提供一种简单、科学的新方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

红云红河烟草集团在用的不同批次不同风格特征的成品香精共181个，均为液态。其中，A.“红河（硬88）”用样品54个，B.“红河（硬99）”用样品56个，C.“红河（硬甲）”用样品71个。

乙酸苯乙酯内标（≥99%，美国Sigma-Aldrich公司）。

6890N/5973N气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent公司），带CIS4进样口的TD-2热解吸系统（德国Gerstel公司）；AB204-S电子分析天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler-Toledo公司）；SIMCA-p11.5+数据处理软件（瑞典Umetrics公司）；ChemPattern化学计量学与化学指纹图谱系统解决方案软件［1.0版，科迈恩（北京）科技有限公司］；有机相针式过滤头（25 mm×0.45μm，昆明楚昊经贸有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 GC/MS分析

取约2 mL香精样品，经有机相滤膜过滤后进行GC/MS分析。分析条件为：

色谱柱：HP-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm i.d.×0.25μm）；载气：高纯氦（纯度≥ 99.999%）；载气流量：1 mL/min，恒流；进样量：1 μL；进样口温度：250 ℃；分流比：10∶1；分流流速：10 mL/min；范围：29～445 amu；溶剂延迟：14.5 min。

1.2.2 指纹图谱提取及化学计量学分析

采用ChemPattern软件，对181个香精样品的GC/MS指纹图谱数据进行预处理，确定其共有模式，然后从ChemPattern软件中，将经过数据预处理及色谱峰保留时间校正对齐后的色谱数据（峰面积）导出至SIMCA-p11.5+，进行主成分分析，构建3类香精的分类模型，通过提取Hotelling T2统计量，监测香精总体品质特性的稳定性变化趋势。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化及方法精密度

2.1.1 色谱条件优化

香精样品中溶剂的量很高，为了消除不同种类溶剂的影响，可选择较大分流比来减小溶剂的影响。然而分流比较大，歧视效应也较大，影响香精样品中一些重要的质量分数较低化合物的检测。在本实验中，对3类香精样品的分流比进行了优化，结果显示10∶1的分流比效果较好。

考虑到香精样品中的成分复杂，含有大量的低沸点组分，因此选择较低的起始温度；另外香精样品成分的沸程跨度较大，为了达到快速分离的目的，选择程序升温来实现香精样品中成分的分离。在本实验中，对程序升温的条件进行优化，得到最优条件如1.2.1节所示，既缩短了分析时间，峰形也较好。

2.1.2 方法的精密度

按照1.2节的预处理方法及色谱条件考察仪器精密度、日内精密度和日间精密度。①仪器精密度：取1份香精样品处理后连续进样5次，计算共有色谱峰相对峰面积的相对标准偏差（RSD）。结果发现，22个共有峰的相对峰面积的RSD均小于5%。②日内精密度：取5份同一香精样品，处理后于同一天内分别进样，计算共有色谱峰相对峰面积的RSD。结果发现，同一天内测定的5个平行样品相对峰面积的RSD均小于10%。③日间精密度：取同一个香精样品，隔天测定1次，共测定5次，计算共有峰相对峰面积的RSD。结果发现，隔天测定共5次的样品共有色谱峰中，相对峰面积的RSD小于10%的峰占90%，其余峰的相对峰面积的RSD在10%～15%之间。以上结果表明仪器精密度较好，方法的日内及日间精密度均满足分析要求。相对峰面积RSD的最大值、最小值及平均值见表1。

2.2 香精的指纹图谱提取

色谱指纹图谱的提取不仅与色谱分离条件有关，还与软件对色谱信息的提取有关，如何去除干扰，提取足够的信息量对化学计量学分析非常重要。本研究中，采用迈恩公司的ChemPattern软件，对香精样品的GC/MS图谱数据进行去背景、积分、剪裁、保留时间校正（对齐），以及色谱峰数据规范化处理等。

表1 方法的精密度考察（RSD，n=5） （%）

色谱峰保留时间的漂移现象属于色谱实验系统误差和不确定性的一部分，在实验中无法完全避免，当待测组分非常复杂时，任何微小的时间飘移均会导致样品间色谱峰匹配错位而造成较大的计算偏差，因此确立色谱峰正确的对应关系是顺利进行化学计量学计算的先决条件。化学计量学针对色谱保留时间的校正提出了不少方法［12-13］。主要是利用加内标或者找出一些共同的标志化合物进行校正，使目标色谱指纹图谱与待校准的色谱指纹图谱的相关系数达到最大时进行校准，当化合物质量分数差别较大时易出现错误匹配。ChemPattern软件采用近邻法［14］，基于特定的保留时间而非图谱中具体的色谱峰，因此不受样品图谱中色谱峰是否发生变化的影响。图1是其中一个样品保留时间校正前后色谱峰匹配镜像图，图2是保留时间校正前后总样品色谱峰匹配示例图。可以看出，经过手动及自动调整，能够正确地解决峰的保留时间漂移和重叠峰的问题。图3为经预处理后部分3类香精样品的GC/MS指纹图谱。

2.3 主成分数的选择与PCA分类模型的建立

应用SIMCA-p11.5+软件中PCA方法，结合A、B、C 3类香精的GC/MS指纹图谱，分别建立主成分分类模型，并提取相应的Hotelling T2统计量作为监测香精品质状态的统计量。在PCA分析过程中，选择适宜主成分数时，主成分特征值（Eigenvalues）一般需要大于2，同时应兼顾主成分分析对原色谱数据的累积解释能力和模型的预测精度。主成分分析对色谱数据矩阵累计解释能力（R2Xcum）值越接近1，对模型的解释能力越好；模型预测精度可通过累计交叉有效性来反映［15］。

分析A、B类香精，当主成分数增到4时，新增加的第四主成分对提升模型预测精度的贡献不显著，所以A、B类香精类模型的适宜主成分数应为3。同理C类香精类模型的适宜主成分数应为2。选用不同主成分数时，PCA分类模型的特征值、R2Xcum、Q2和Q2cum见表2。图4为3类香精的第一、第二主成分得分 t［1］/t［2］分布示意图。从图 4 可知，在95%的置信范围内，131个香精样品明显分为3类。

2.4 PCA分类模型的应用

分别对A、B、C 3类香精50个样品进行Hotelling T2统计量监测验证，验证结果见表3。设置95%置信限为控制线，99%置信限为预警线，A、B类香精的验证样品均得到正确预测。以C类香精为例，图5为C类香精以PCA分类模型建立的Hotelling T2统计量监测示意图，可用来衡量样本到主成分空间原点的距离，从而评估被监测样品色谱的离散程度。

表2 A、B和C 3类香精PCA类模型的相关统计量

表3 3类香精的Hotelling T 2统计量验证结果

由图5可知，C类香精20个验证样品中大部分的Hotelling T2统计量均在95%（Hotelling T2=6.35）置信范围内波动，其中配方错误的68#、69#、70#3个样品超出了控制线95%（Hotelling T2=6.35），被人为错误归类的60#样品超出了预警线99%（Hotelling T2=9.99），该结果与68#、69#、70#、60#4个香精样品的相对密度（d2020）及折光指数（nD20）检测值异常情况（相对偏差绝对值均大于10%）一致，C类香精4个样品的相对密度及折光指数结果见表4。结果表明：以Hotelling T2统计量的99%置信限作为品质控制限，95%置信限作为品质预警限，建立的分类模型能正确预测C类香精的品质波动。

表4 4个香精样品的相对密度及折光指数

3 结论

①GC/MS指纹图谱结合Hotelling T2统计量建立的香精主成分分类模型，能准确预测香精品质的波动情况。②本方法可配合常规技术对香精整体品质的稳定性进行监测。

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