脑卒中后抑郁大鼠行为学的动态变化及中药补阳还五汤的干预作用

罗 琳，邓叔华，易 健，周赛男，佘 颜，刘柏炎，2

(1.湖南中医药大学，长沙 410208;2.益阳医学高等专科学校，益阳 413000)

脑卒中是一种对人类健康和生命安全造成极大威胁的难治性疾病，具有高发病率、高致残率和高死亡率的特点。卒中不仅导致患者运动功能障碍出现偏瘫，同时患者也出现不同程度的心理、认知和语言功能的障碍，产生一系列情感行为学方面的变化，称为脑卒中后抑郁(post－stroke depression，PSD)。PSD是卒中后最常见和最严重的神经精神并发症之一，约有1/3的脑卒中患者出现抑郁症状［1］，不但严重影响患者神经功能的康复，显著降低患者的生活质量，而且死亡率高达非PSD患者的3～4倍［2］。因此，对PSD患者进行早期而有效的防治具有非常重要的现实和社会意义。抑郁症的显著特征之一是行为学的改变，其也是检测实验中抑郁动物模型成功与否的重要指标，本研究采用复合法制备脑卒中后抑郁大鼠模型，通过中药补阳还五汤的干预，并用氟西汀作对照，分别在应激前和应激后7 d、14 d和21 d进行行为学测试，以期动态观察补阳还五汤对脑卒中后大鼠行为学的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物及实验环境

SPF级雄性SD大鼠60只，体重(220～250)g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号［SCXK(湘)2011－0005］。饲养于湖南中医药大学动物实验中心SPF级饲养间内，使用许可证号:［SYXK(湘)2008－0003］。

1.2 药物与仪器

补阳还五汤处方组成:黄芪120 g，归尾6 g，赤芍 4.5 g，红花 3 g，川芎 3 g，桃仁 3 g，干地龙 3 g。药材均购自湖南中医药大学附属一医院门诊药房，药剂水煎滤出药渣浓缩成每毫升含生药2 g，冷藏待用;盐酸氟西汀胶囊:礼来苏州制药有限公司，药品批号:国药准字J20080016。SMART2.5系统及立柱体旷场箱设备(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，WD－9405B型水平摇床(北京市六一仪器厂)，穿梭箱(西班牙Panlab公司)。

1.3 分组与给药

大鼠适应性饲养1周，1周后测旷场试验(openfield test，OFT)基线值，选择评分相近的大鼠60只随机分为:假手术组、卒中组、PSD组、补阳还五汤组、氟西汀组，共5组，每组12只。假手术组、卒中组每笼饲养6只，其余各组每笼饲养1只。给药时间为21 d，从应激后第1天开始，每天灌胃1次，每周测体重1次，根据体重变化更新剂量。补阳还五汤组每日灌胃1次，用量为13.26 mg/kg补阳还五汤药液(按体表面积计算相当60 kg成人用量的3倍);氟西汀组予氟西汀溶液每日等容积混悬液灌胃1次，用量为1.54 mg/kg;余下各组均每日等容积灌胃蒸馏水10 mL/kg灌胃。

1.4 模型制备

采用大脑中动脉栓塞法(middle cerebral artery occlusion，MCAO)制备脑缺血大鼠模型，并在此基础上，给予孤养和慢性不可预知的温和应激法(chronic unpredictable mild stress，CUMS)联合制备PSD模型。脑缺血大鼠模型:参照 Zea－Longa文献［3］制备右侧大脑中动脉栓塞(MCAO)大鼠模型，动物术后参照Bederson［4］的5分制法对术后清醒大鼠进行神经功能评分，分值在l～3分者入组，死亡不足动物再随机补充。假手术组动物，除在手术过程中不插入钱栓以外，其他的过程相同。⑵CUMS模型:术后参照文献［5］方法略加改进:①禁食禁水21 h;②行为限制30 min;③45°倾斜鼠笼24 h;④昼夜颠倒24 h;⑤水平摇晃5 min;⑥湿笼(100 g锯屑加200 mL水)24 h;⑦声电刺激(电压0.9mA)8次/只等7种。每天随机选取一种应激，相同应激不连续出现，每种应激出现3次共21 d。假手术组除每天抓取1次外，不做其他处理。⑶孤养:大鼠单笼饲养。

1.5 行为学检测

1.5.1 体重检测:在术前1d和 CUMS后第7、14、21天对各组大鼠进行体重测量。

1.5.2 神经功能评分:除假性手术组外，其余各组于CUMS后第 7、14、21天运用 Ayelet Levy评分法［6］评价各组大鼠不同时间点神经功能恢复情况。评分:(1)提住尾巴将小鼠逐渐提高:前肢屈曲1分，后肢屈曲1分，30s内头移动与纵轴形成角度＞10°1分;(2)将小鼠置于地面:正常爬行0分，无法直线爬行1分，沿患侧转圈2分，患侧跌倒3分;(3)梁平衡测试:静态姿势下可平衡0分，抓握梁边1分，抱住梁，有一肢体掉落2分，抱住梁，有两肢体掉落，或在梁上旋转(＞60s)3分，试图在梁上保持平衡，但跌落(＞40 s)4分，试图在梁上保持平衡，但跌落(＞20s)5分，跌落，但没有试图保持平衡或抓握梁(＜20s)6分;(4)反射缺失或异常动作:耳廓反射(当触耳道时摇头)1分，角膜反射(用棉花丝轻触角膜时眨眼)1分。因此，分数越高，损伤程度越重。

1.5.3 蔗糖水消耗实验［7］:于术前 1 d和 CUMS后第7、14、21天对各组大鼠进行糖水消耗试验。实验前训练大鼠饮用l%蔗糖水，即在每个鼠笼放置2个水瓶，在开始的24 h内两瓶均装有1%蔗糖水，随后第2个24 h内1个瓶装纯净水，另1个瓶装1%蔗糖水。进行试验测定时大鼠禁食禁水20 h，然后给予每只测试大鼠一瓶1%蔗糖水和一瓶纯净水，1 h后取瓶测量计算动物的糖水饮用比率(糖水消耗量/总液体消耗量×100%)。

1.5.4 旷场实验［8］:于术前 1 d 和 CUMS 后第 21天进行矿场实验。采用立柱体旷场箱，规格(100×100×40)cm，周壁、底面为黑色。将大鼠置于旷场箱底面的中心，用SMART实时视频图像跟踪分析系统记录大鼠在3 min内的移动距离(travelled distance，Dist)、平均速度(不包含休息时间)(speedaverage(without resting time)，V.Avge)。测试时在光线昏暗、安静的环境下进行，每次测定结束后清除干净动物的排泄物，每只只测定1次，实验时间结束后通过录像分析软件统计结果。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。计量资料数据以均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析。所有统计均以P＜0.05作为差异有显著性。

2 结果

2.1 各组大鼠不同时期体重比较

由表1结果可见，术后应激第7天起PSD组、卒中组较假手术组体重增幅减慢(P＜0.05或P＜0.01)，且PSD组体重降低更明显;应激第14 d、21 d卒中组体重增长逐渐恢复正常，而PSD组体重增幅明显减慢(P＜0.01);补阳还五汤干预后在应激第7天与PSD组相比体重增加(P＜0.05)，第14、21天体重增加明显高于PSD组(P＜0.01)，氟西汀和补阳还五汤组之间差异无统计学意义，说明补阳还五汤及氟西汀能改善卒中后抑郁大鼠模型的抑郁状态，增加大鼠体重。

2.2 神经功能评分比较

由表2结果可见，通过Ayelet Levy评分法检测，各组大鼠在术后均出现了程度不等的神经功能缺损，术后应激第7天神经功能评分比较各组差异无统计学意义(P＞0.05);随后PSD组大鼠神经功能评分逐渐增加，第14、21天与卒中组比较有统计学差异(P＜0.05或 P＜0.01);治疗组氟西汀和补阳还五汤组其神经功能评分逐渐降低，且与PSD组比较差异具有统计学意义(P ＜0.05或P＜0.01)，表明其均促进其神经功能恢复，但氟西汀组和补阳还五汤组比较差异无统计学(P＞0.05)。

表1 各组大鼠不同时间点体重比较(n=10，±s，g)Tab.1 Comparison of the body weight of rats in each group at different time－points(n=10，±s，g)

表1 各组大鼠不同时间点体重比较(n=10，±s，g)Tab.1 Comparison of the body weight of rats in each group at different time－points(n=10，±s，g)

注:与假性手术组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01;与卒中组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;与 PSD 比较，﹡P ＜0.05，﹡﹡P ＜0.01。Note.Compared with the sham operation group，#P ＜0.05，##P ＜0.01;Compared with the cerebral ischemic stroke group，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;Compared with the PSD group，﹡P ＜0.05，﹡﹡P ＜0.01.

应激第21天Stress，21 days假性手术组 Sham operation group 250.90 ±18.30 285.55 ±18.04 310.58 ±22.77 333.66 ±25.05卒中组 Stroke group 258.63 ±16.33 266.35 ±17.19# 288.58 ±20.05 309.69 ±21.28 PSD 组 PSD group 260.82 ±17.90 250.44 ±16.82## 263.80 ±14.87##△ 277.09 ±14.77##△氟西汀组 Fluoxetine group 257.07 ±17.75 267.03 ±18.60 288.00 ±23.29* 309.81 ±22.50*补阳还五汤组 Chinese medicine group 260.66 ±20.02 278.81 ±18.09* 308.38 ±19.27＊＊ 329.09 ±20.69组别Groups 应激前Before stress应激第7天Stress，7 days应激第14天Stress，14 days＊＊

表2 各组大鼠神经功能评分比较(n=10，±s)Tab.2 Comparisons of neurological score in the rats of each group(n=10，±s)

表2 各组大鼠神经功能评分比较(n=10，±s)Tab.2 Comparisons of neurological score in the rats of each group(n=10，±s)

注:与卒中组比较，△P ＜0.05，△△P＜0.01;与 PSD比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note.Compared with the cerebral ischemic stroke group，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;Compared with the PSD group，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

应激第14天Stress，14 days组别Group 应激第7天Stress，7 days Chinese medicine group应激第21天Stress，21 days假性手术组 Sham operation group 7.83 ±1.66 6.40 ±1.50 5.10 ±1.62卒中组 Stroke group 8.27 ±1.45 8.98 ±1.76△ 9.22 ±1.59△△PSD 组 PSD group 6.73 ±1.70 5.44 ±1.51* 3.86 ±1.73＊＊氟西汀组 Fluoxetine group 6.55 ±1.83 4.30 ±1.80△＊＊ 2.91 ±1.63△＊＊补阳还五汤组

2.3 蔗糖水消耗实验

由表3结果可见，造模前各组大鼠饮用糖水消耗比例无明显差异(P＞0.05);从术后应激第7天起PSD模型组糖水消耗率呈下降趋势，且与假手术组、卒中组有显著性差异(P ＜0.05或P ＜0.01);给予药物干预后，氟西汀组在应激14 d、21 d糖水消耗率有所上升，与PSD组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，而补阳还五汤组在应激第7天与PSD模型组比较就明显增加了糖水消耗率(P＜0.05)，说明在一定阶段其疗效优于氟西汀，补阳还五汤组在应激14 d、21 d与PSD组比较均可明显增加糖水消耗率(P ＜0.01)。

2.4 旷场实验

由表4结果可见，术后应激21 d后，PSD组大鼠运动总路程显著缩短，运动平均速度明显减低，与卒中组、假性手术组比较有统计学差异(P＜0.05或P ＜0.01);通过补阳还五汤干预治疗后运动总路程明显增加、运动平均速度也明显加快，与PSD组比较差异有统计学意义(P ＜0.05或P ＜0.01);而补阳还五汤组与氟西汀组在运动总路程和平均速度上差异均无统计学(P＞0.05)。说明补阳还五汤和氟西汀均可增加卒中后抑郁大鼠移动距离和平均速度。

表3 各组大鼠不同时间点糖水消耗率比较(n=10，±s，%)Tab.3 Comparisons of sugar consumption in the rats of each group at different time－points(n=10，±s，%)

表3 各组大鼠不同时间点糖水消耗率比较(n=10，±s，%)Tab.3 Comparisons of sugar consumption in the rats of each group at different time－points(n=10，±s，%)

注:与假性手术组比较，#P ＜0.05##P ＜0.01;与卒中组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;与 PSD 比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与氟西汀比较:☆P＜0.05。Note.Compared with the sham operation group，#P ＜0.05，##P ＜0.01;Compared with the cerebral ischemic stroke group，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;Compared with the PSD group，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;Compared with the fluoxetine group，☆P ＜0.05.

应激第21天Stress，21 days假性手术组 Sham operation group 81.62 ±8.02 77.05 ±5.63 81.44 ±9.04 83.28 ±7.40卒中组 Stroke group 80.06 ±6.22 78.87 ±8.04 80.62 ±6.64 82.63 ±5.55 PSD 组 PSD group 80.93 ±5.58 68.04 ±5.46#△ 54.33 ±8.22##△△ 42.70 ±7.71##△△氟西汀组 Fluoxetine group 78.80 ±7.25 69.22 ±5.80#△ 76.62 ±5.08＊＊ 79.33 ±4.66＊＊补阳还五汤组 Chinese medicine group 77.75±7.80 76.94±4.48＊☆ 79.01±6.62＊＊ 81.71±7.04组别Group 应激前Before stress应激第7天Stress，7 days应激第14天Stress，14 days＊＊

表4 各组大鼠旷场实验测定结果比较(n=10，±s)Tab.4 Comparison of open－field test results in the rats of each group(n=10，±s)

表4 各组大鼠旷场实验测定结果比较(n=10，±s)Tab.4 Comparison of open－field test results in the rats of each group(n=10，±s)

注:与假性手术组比较，#P ＜0.05##P ＜0.01;与卒中组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;与 PSD 比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note.Compared with the sham operation group，#P ＜0.05，##P ＜0.01;Compared with the cerebral ischemic stroke group，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;Compared with the PSD group，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

造模前Before modeling组别Groups应激后After stress造模前Before modeling应激后After stress假性手术组Sham operation group 1246.20 ±145.78 1503.08 ±282.60 13.08 ±3.65 12.77 ±2.28卒中组 Stroke group 1333.09 ±212.62 1498.24 ±352.64 12.69 ±4.24 10.46 ±3.83 PSD 组 PSD group 1378.75 ±268.08 838.57 ±265.50##△△ 12.04 ±2.66 6.05 ±4.09#△氟西汀组 Fluoxetine group 1447.78 ±303.66 1315.66 ±312.21＊＊ 10.91 ±4.09 10.88 ±2.45*补阳还五汤组 Chinese medicinegroup 1293.34 ±255.07 1499.32 ±277.42＊＊ 11.57 ±2.88 12.63 ±2.66*

3 讨论

现代医学认为，PSD是以精神和躯体症状相结合的复杂的神经精神情感障碍性疾病，它是各种神经生物学和社会心理因素综合作用的结果，其发病符合生物－心理－社会医学模式，即PSD的发生既是卒中后出现了颅内特定部位损伤的直接结果，又是卒中这一突发应激事件给患者带来各种心理反应及社会因素影响的结果［9］。中医学辨证认为，PSD属于“郁证”范畴，因其发生在中风之后，又将其归为中风与郁证之合病，属于“因病致郁”;卒中后气虚血瘀、血瘀阻络为其病机核心，又因肢体偏瘫等因素思虑过度，情志不舒，伤及肝脾二脏为其发病的最重要原因［10］。因此目前多数医家认为本病病位在脑，涉及肝、脾、肾等，其证属本虚标实或虚实夹杂，病之本属精气血亏虚，病之标则为痰瘀互结［11］，故治疗上基于急则治标、缓则治本的原则，在辨证论治原有疾病的基础上，以补气活血通络为治其本。本实验所选补阳还五汤是补气行瘀、疏通经络的代表方剂，是治疗中风后遗症的经典名方，方中当归、川芎、赤芍、桃仁、红花活血化瘀，地龙通经活络，并重用黄芪大补元气，使全方具有补气而不留邪，活血而不伤正之功效［12］。

本实验首先通过线栓法制备脑缺血卒中模型造成大鼠脑血管急性病理损伤，再运用孤养法及慢性不可预知的温和应激法联合模拟恢复期负性压力环境制备PSD模型大鼠，目前该模型广泛应用于PSD形成机制和药物疗效评价的研究［13］。对于PSD大鼠的显著特征之一—行为学的观察，其体重变化、糖水消耗实验和旷场实验是反映动物抑郁症状和躯体症状的关键指标，因此本研究用以上三个重要指标来综合评价补阳还五汤对PSD大鼠的干预作用。

临床上抑郁症病人通常会出现食欲下降、体重减轻现象，所以体重的变化是衡量PSD大鼠的量化指标之一。本实验研究发现，在应激刺激第7d、14d、21dPSD组大鼠体重增幅明显减慢，与假手术组比较有显著性差异，而卒中组在第14d后体重增幅逐渐恢复正常，提示应激事件影响到了动物体重的增长;给予药物干预的氟西汀组和补阳还五汤组，均能明显改善PSD大鼠体重增长情况，提示中药补阳还五汤干预对促进食物的吸收有一定促进作用，可以缓解动物因应激事件引起的体重增幅减慢的现象。

兴趣缺乏、快感缺失是CUMS模型动物抑郁行为中最为核心的症状之一，啮齿类动物快感缺失的定量评价方法主要为糖水消耗实验［14］。本实验研究结果显示，基于啮齿类动物喜好糖水的天性，经过应激处理的PSD组大鼠的糖水消耗量明显较假手术组和卒中组大鼠下降，表明PSD大鼠对奖赏机制的敏感性减低，出现了明显的抑郁症状。而通过氟西汀、补阳还五汤药物干预的大鼠糖水消耗量明显增加，且补阳还五汤组在应激第7天与PSD组比较就明显增加了糖水消耗率，说明在一定阶段其疗效优于氟西汀，提示补阳还五汤能增加PSD大鼠对奖赏机制的敏感性，减轻其抑郁症状。

旷场实验由Hall在1934年提出，用于观察动物在特定陌生环境一定时间内中的自发活动行为，是反应大鼠对未知环境的探索能力及情绪反应的经典实验。本实验采用小动物视频图像跟踪分析系统，动态分析大鼠在旷场箱中的活动轨迹，

以运动总路程和平均速度等为观察指标，能更直接地反应动物的抑郁程度，从而避免了传统的人为观察记录动物的跨格次数所造成标准不一致性、主观性程度大以及费时费力等缺点，取得更加真实准确的实验数据［15］。实验结果显示，通过21d的应激刺激后，PSD组大鼠总路程显著缩短，运动平均速度明显减低，与卒中组、假性手术组比较有统计学差异，说明动物对未知环境出现了兴奋性和探索能力降低等症状，与抑郁症状具有一定相似性。而给予干预治疗后运动总路程明显增加、运动平均速度也明显加快，提示补阳还五汤干预可以改善PSD大鼠的探索性活动，缓解抑郁症状。

以往研究表明脑卒中后抑郁的发生与脑卒中的亚型无关，而与脑卒中后的神经功能损伤程度有关，神经功能的恢复有助于脑卒中后抑郁症状的缓解［16－17］。本实验结果也显示，应激 14d、21d 后 PSD组大鼠神经功能评分逐渐增加，神经功能损伤加剧，与卒中组比较有统计学差异。而给与药物干预后，神经功能恢复良好。

综上所述，本文对卒中后抑郁大鼠的行为学变化进行了初步探讨，显示补阳还五汤具有一定的治疗PSD的效果，不但减轻了PSD大鼠的抑郁程度，而且对卒中引起的神经功能缺损有良好的恢复作用，充分发挥了中药多靶点、多效应的作用，但其具体的作用机制还有待今后从显微形态学、分子生物学等方面进行深入的探究。

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