人工设计二硫键增强谷氨酰胺转胺酶热稳定性

刘中美， 杜 坤， 周哲敏

（江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122）

谷氨酰胺转胺酶（Transglutaminase，TGase，EC 2.3.2.13）是一种能够催化酰基转移反应的酶。它可以催化谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基与各种酰基受体发生反应，实现蛋白质分子内、分子间交联，从而极大地改变蛋白质的性质[1]。TGase广泛应用于食品行业、生物医药、组织工程、纺织和皮革处理等多个领域[2-3]。由于TGase的卓越催化功能而倍受越来越多的研究者的青睐，它被誉为 “21世纪超级粘合剂”。

对TGase的研究可以追溯到50年前，美国生物化学家Heinrich Waelsch在人脑和肝脏提取物中首次发现具有酰胺基转移催化功能的TGase酶[3]。微生物来源的 TGases （Microbial TGase，MTG）是1989年日本味之素公司首次发现的，由土壤中分离出的茂原链霉菌（Streptomyces mobaraense）产生[4]。与其它来源的TGase相比，MTG具有非Ca2+依赖性、温度和pH稳定性高等特点[5-6]。此外，MTG生产周期短、产量高、成本低，易于工业化生产。S.mobaraense来源的MTG一级氨基酸序列于1993年被测定[7]，由331个氨基酸组成，与动物来源的TGase相比，二者序列相似度低。S.mobaraense MTG的晶体结构于2002年被解析，二级结构属于α+β型，含11个α-螺旋及8个β-折叠；催化活性基团Cys64、Asp255和His274均位于分子裂缝底部[8]。

目前，微生物来源的MTG已经实现了商品化（ActivaTM），ActivaTM中每克粉末中含有100个单位的酶活，但是其中只有体积分数1%的蛋白，体积分数99%的是麦芽糖糊精。麦芽糖糊精的作用是增强MTG的稳定性和使产品易于操作[9]，因为酶的热稳定性越好，在应用过程中可耐受的操作温度越高，反应速率越快，成本也就越低。德国马丁路德大学的Pietzsch研究组利用随机突变和饱和突变等技术，提高了S.mobaraense来源的MTG的热稳定性。研究结果表明，影响MTG热稳定性的突变点大都集中在MTG的N端区域[10]。

作者参考Pietzsch研究组的实验结果，采用理性设计手段，通过分子生物学技术、结构分析软件、分子模拟等手段对Streptomyces hygroscopicus来源的MTG进行分子改造。通过结构比对和序列分析，并借助二硫键预测软件Disulfide by design，在MTG的N端区域引入二硫键，使MTG的热稳定性得到提高，进一步促进其工业化应用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒 质粒pET22b-pro-MTG、E.coli BL21（DE3）和E.coli JM109为本实验室保存。

1.1.2 试剂与仪器 N-carboxybenzoyl-L-glutaminyl-glycine （N-CBZ-Gln-GLy）、L-谷氨酸-γ-单羟胺酸购自Sigma公司；中性蛋白酶Dispase：购自Worthington公司，PCR引物：生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

紫外分光光度计（UV-1800）：上海美谱达有限公司产品；HiTrap Q HP和HiTrap SP HP：GE公司产品；AKTA avant：GE 公司产品；Millipore 超滤离心管 Ultra-15 3K，默克公司产品。

1.1.3 主要培养基 LB培养基：10 g/L蛋白胨，5 g/L 酵母提取物，10 g/L NaCl，pH 7.0。 TB 培养基：12 g/L蛋白胨，24 g/L酵母提取物，体积分数0.4%甘油，17 mmol/L KH2PO4，72 mmol/L K2HPO4，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 构建分泌表达载体 pET22b-pro-MTG（4-284）以载体pET22b-pro-MTG[11]为模板，D4C-up和D4C-down为引物，进行全质粒PCR，得到重组质粒pET-pro-MTG （D4C）。 以载体pET-pro-MTG（D4C）为模板，G284C-up和G284C-down为引物，进行全质粒PCR，获得重组质粒pET-pro-MTG（4-284）。引物序列见表1，质粒均经过测序验证。

表1 研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 重组蛋白酶的诱导表达 将转化子接于含有50 mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，37℃过夜培养后转接至TB培养基中 （含有4 g/L葡萄糖和50 mg/L氨苄青霉素），37℃条件下培养至OD600为0.5~0.6，加入IPTG至终浓度为0.4 mmol/L，20℃条件下诱导40 h。

1.2.3 酶原活化与蛋白质纯化 参照报道[12]，收集发酵液，并在发酵液中加入终质量浓度为5 mg/L的中性蛋白酶Dispase，37℃保温1 h，活化pro-MTG和 pro-MTG（4-284）。活化完成后，硫铵沉淀法（硫酸铵浓度55%~75%）收集目标蛋白，复溶于10 mmol/L磷酸钾缓冲液（pH 6.0）。

将复溶液经过层析柱HiTrap SP HP分离纯化，用含0.5 mmol/L NaCl的磷酸钾缓冲液（pH 6.0）进行线性洗脱。收集含有目标蛋白的峰，并将收集的样品于25 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）中透析过夜。将透析样品离心取上清，注入HiTrap Q HP离子柱，并用含有0.5 mmol/L NaCl的25 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）溶液进行线性洗脱，收集目标蛋白。用SDS-PAGE凝胶电泳来检测目标蛋白纯度，Brandford法检测蛋白质浓度。

1.2.4 检测蛋白的二硫键含量 参照文献[13]，将蛋白MTG和MTG（4-284），分别稀释在含有和不含有还原剂（10 mmol/L DTT）的溶液 A（80 mmol/L磷酸钾缓冲液，质量分数2%SDS，pH 8.0）中，在沸水中煮10 min使蛋白变性。用超滤离心管（Millipore Ultra-15 3K）浓缩蛋白，同时用溶液A洗去DTT，然后取样测蛋白质浓度。测定各样品的吸光度值，计算各样品在有DTT和无DTT存在时，半胱氨酸含量的变化，进而算出二硫键的含量。

1.2.5 酶学性质与热稳定性测定 将重组MTG和MTG（4-284）分别在 37、45、50、55、65 ℃下处理 10 min，然后在冰上冷却30 min。以N-CBZ-Gln-GLy（30 mmol/L）为底物，用比色法测定MTG酶活[11]。一个单位谷氨酰胺转胺酶酶活的定义为：37℃时每分钟催化形成1 μmol L-谷氨酸-γ-单羟基肟酸的酶量。

1.2.6 圆二色谱 用10 mmol/L磷酸钾缓冲液稀释至蛋白质质量浓度为0.2 mg/mL，通过MOS-450/AF-CD分光偏振计分别测定重组MTG和MTG（4-284）的T50值。吸收池宽10 mm，检测波长为222 nm，温度范围为40~80℃。

1.2.7 抗胰蛋白酶降解测试 将纯化后的蛋白样品稀释至0.5 mg/mL并分别加入终浓度为0.1 U/mL的胰蛋白酶。37℃保温3 h，每隔0.5 h取样一次，用SDS-PAGE凝胶电泳检测蛋白的降解程度。

1.2.8 同 源 建 模 通 过 Swiss-Model（http：//swissmodel.expasy.org/）对来源于 S.hygroscopicus的MTG进行同源建模，具体方法参见网站上的说明。模板为来源于Streptomyces mobaranesis的MTG（1IU4），两者之间的氨基酸序列同源性为79.2%。利用 PROCHECK （http：//nihserver.mbi.ucla.edu/SAVES/）对模型空间结构的准确性进行评估，结果显示所有的氨基酸都是在合理的位置，表明构建的模型准确性较高。

2 结果与讨论

2.1 MTG上二硫键位置的选取及质粒构建

S.mobaraense来源的MTG的N端区域对于MTG的热稳定性起着很关键的作用[10]。S.hygroscopicus和S.mobaraense来源的MTG的序列同源性高达79.2%，因此推断S.hygroscopicus来源的MTG的N端区域对其热稳定性同样重要，在该区域设计二硫键预期可以提高其稳定性。

通过同源建模获得S.hygroscopicus来源的MTG的三维结构图（图1）。选定N端的Loop区作为改造的目标，利用Disulfide by Design软件在目标区域预测二硫键的氨基酸位点，结果显示在D4和G284之间可能形成二硫键。构建突变体质粒pET-pro-MTG（4-284），以检测二硫键对MTG热稳定性的影响。

图1 三维结构图Fig.1 3D structure comparison of MTG

2.2 MTG和MTG（4-284）的表达、活化与纯化

MTG和MTG（4-284）进行胞外表达，经过中性蛋白酶Dispase活化、硫酸铵分级沉淀 （质量分数55%~75%）、阳离子层析和阴离子层析后，获得了纯度较高的MTG和MTG（4-284），SDS-PAGE结果如图2所示。

2.3MTG和MTG（4-284）的二硫键数量测定

二硫键的数量是通过对比MTG和MTG（4-284）在还原性环境（经DTT处理）和非还原性环境（未经DTT处理）下的巯基含量来确定的[13]。结果如表2所示，MTG在经DTT处理前后，其巯基含量基本没有变化。每个MTG内只含有1个巯基，这和已知的蛋白序列只含一个半胱氨酸相一致。MTG（4-284）在经DTT处理后，检测到的巯基含量约是DTT处理前的3倍，这说明经DTT处理后，一个二硫键被打开了，进而释放出了两个巯基。实验结果表明MTG（4-284）内形成了一个二硫键。

图2 纯化蛋白电泳图Fig.2 SDS-PAGE analysis of the purified proteins

表2 MTG和MTG（4-284）的二硫键数量Table 2 Disulfide numbers of MTG and MTG（4-284）

2.4 MTG和MTG（4-284）的热稳定性比较

将 MTG 和 MTG（4-284）在 37、45、50、55、60 ℃分别下处理10 min，再冰浴30 min，进行酶活检测。如图 3所示，MTG和 MTG（4-284）在 45℃处理 10 min后，酶活基本没有降低，表明在该温度下MTG的热稳定性较好。MTG在50~60℃的环境下酶活随着温度的升高而迅速降低，而MTG（4-284）在55℃下处理10 min后，仍然保留95%的酶活，表明MTG（4-284）的热稳性有了很大的提高。

圆二色谱技术测定MTG和MTG（4-284）的T50分别为 58 和 65℃（图 4），表明 MTG（4-284）的蛋白质在变性和解折叠过程中所需的温度均有所提高，反映出其热稳定性提高了。这与热处理后检测酶活的结果一致。以上结果表明在S.hygroscopicus来源的MTG的N端区域引入二硫键可以提高其热稳定性。

图3 MTG和MTG（4-284）的热稳定性Fig.3 Thermostability of MTG and MTG （4-284）at different temperature

图4 MTG 和 MTG（4-284）的 T50Fig.4 The T50of MTG and MTG（4-284）

2.5 MTG和MTG（4-284）的抗胰蛋白酶降解能力比较

胰蛋白酶经常被用来检测蛋白酶的抗降解能力。从图5中可以看出，MTG在经过3 h的胰蛋白酶处理后，目标条带基本消失，在27 000左右出现一个明显条带。而MTG（4-284）在处理3 h后，依然有着比较明显的条带，下方也没有出现降解的蛋白条带。以上结果显示MTG（4-284）抗胰蛋白酶降解的能力明显增强。

MTG（4-284）热稳性和抗蛋白酶降解的能力都有所提高，进一步表明在N端引入二硫键有效的提高了MTG（4-284）的稳定性。

3.6 MTG和MTG（4-284）的酶学性质比较

MTG（4-284）的比酶活略低于MTG；Km和kcat的结果显示，引入的二硫键使得kcat变化略大，Km值变化很小，表明二硫键的引入基本没有影响酶与底物的结合，而是底物进入活性中心后，酶分子完成催化所需的时间受到了一定的影响；MTG（4-284）在热稳定性提高的同时，最适反应温度也有所提高。

3 结语

作者通过在MTG的N端区域人工设计并引入二硫键，有效提高了其稳定性。圆二色谱检测结果表明二硫键的引入使得其T50由58提高至65℃；酶活力检测结果表明二硫键的引入导致比酶活略有所下降，由13.3 U/mg下降为12.5 U/mg；酶动力学参数表明二硫键的引入没有影响酶与底物的结合过程，而是影响了底物进入活性中心后的催化过程。作者研究结果表明S.hygroscopicus来源的MTG的N端区域对于其稳定性重要影响，而该区域相对远离活性中心，也比较适合进行分子改造。

图5 MTG（a）和MTG（4-284）（b）抗胰蛋白酶降解比较Fig.5 Trypsin-resistance of MTG（a）and MTG（4-284）（b）

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