NGF重组腺病毒在螺旋神经节细胞中的转染特性

池 君，宋武战，范泉水，张学渊，刘 丹，游建军

研究表明，螺旋神经节细胞中存在着微量的神经生长因子（nerve growth factor,NGF），其细胞中亦分布着NGF的高效受体TrkA[1-2]，NGF要通过与其受体TrkA结合，启动细胞内的信号途径而发挥保护神经元、促进神经元存活等作用。由于耳蜗螺旋神经节细胞（spiral ganglion neurons，SGNs）在听觉损伤和恢复中发挥重要作用，如何利用转基因技术提高细胞中NGF含量，使SGNs能在耳蜗内长期存活，将为感音神经性耳聋的基因治疗提供新的途径。本实验将外源性NGF通过腺病毒导入SGNs中，观察转染后SGNs的变化和存活时间。

1 材料与方法

1.1 动物及材料 选用出生后3 d健康的SD大鼠10只（20耳）（购自昆明医学院实验动物中心，许可证号SYXK2005-0004），雌雄不限。随机分成两组，每组5只（10耳）。A组为NGF重组腺病毒转染组，B组为非转染组。携带有小鼠NGF基因的重组腺病毒制备参考文献[3]。

1.2 腺病毒转染离体培养的螺旋神经节细胞 耳蜗螺旋神经节细胞的分离、培养参考文献[4]。A组中，当螺旋神经节细胞培养至第 时，将 孔板中原有的培养液吸出一半，加入500 μl腺病毒液；37℃5%CO2细胞培养箱中孵育2 h，再加入新的细胞培养液；48 h后半量换液；B组不加入病毒液，培养同前。每天观察细胞形态和荧光变化，两组细胞均培养14 d。

1.3 蛋白质免疫印迹检测转染前后SGNs中NGF的变化 终止培养后，A、B两组分别行蛋白质免疫印迹检测。按常规制备10%的SDS-PAGE凝胶，上样后电泳，5%积层胶中电压为80 V，样品进入分离胶后电压调至120 V；电泳完毕后，将凝胶上的蛋白质电转至硝酸纤维素膜（NC）上。丽春红染色观察是否有蛋白质条带，然后进行下一步操作。封闭1 h，孵育兔抗鼠多克隆抗体NGF（一抗）（北京博奥森生物技术有限公司），稀释倍数1∶500，4℃过夜；TBST液漂洗3次，15 min/次，浸入含HRP标记的羊抗兔IgG （北京中山生物技术有限公司，1∶1000）的二抗中，37℃ 1 h，TBST液漂洗3次，15 min/次， 化学发光法显影，X胶片记录结果。

2 结果

2.1 B组离体培养的螺旋神经节细胞 在分离培养的螺旋神经节细胞中，种植后24 h，可见6孔板底部有细胞贴壁，此时细胞突起短，随着培养时间的延长，突起逐渐长出。培养第5 d，可见SGNs胞体多呈椭圆形，胞体周围呈现一圈光晕，胞体边缘光滑，细胞透明，胞浆均质，折光性好。细胞突起细长，突起的长度一半大于胞体直径的2～3倍，可见轴浆多处局部膨起，少数细胞的突起相互交织（图1）。培养第10 d，部分细胞突起消失，胞体呈不规则形，贴壁差，少数细胞漂浮在培养液中（图2）。培养至第14 d时，多数细胞漂浮，细胞崩解死亡。

2.2 A组离体培养的螺旋神经节细胞 培养开始至加入腺病毒前，SGNs的形态同B组。重组腺病毒转染SGNs后第2 d（即培养5 d），倒置显微镜下可见SGNs贴壁良好，荧光显微镜下可见部分细胞胞体和突起发出荧光，强度较弱（图3）；第5 d（即培养8 d），约有80%～90%的细胞发出荧光，强度增强，细胞形态结构正常，贴壁良好，许多细胞的突起交织成网（图 4）。 第 11 d（即培养 14 d），约 50%细胞仍有荧光发出，半数细胞贴壁良好（图5）。分别对离体培养10 d的两组SGNs计数，B组细胞较A组显著减少（P ＜ 0.05）。

图1 离体培养5 d的SGNs（×100）

图2 离体培养10 d的SGNs（×100）

图3 重组腺病毒转染第2 d绿色荧光蛋白在SGNs中的表达（×100）

图4 重组腺病毒转染第5 d绿色荧光蛋白在SGNs中的表达（×200）

图5 重组腺病毒转染第11 d绿色荧光蛋白在SGNs中的表达（× 200）

2.3 两组NGF在SGNs中的表达 重组腺病毒转染A组后，采用蛋白质免疫印迹法分别检测两组的NGF含量，结果A组的NGF总蛋白灰度值的均数为 0.718 24±0.036 92，显著高于 B 组的 0.243 58±0.007 58（P ＜ 0.01，图 6），提示转染后 A 组螺旋神经节细胞中NGF的含量高。

图6 蛋白质免疫印迹法检测NGF在SGNs中的表达左侧B组；右侧A组

3 讨论

迄今已有多种体系的真核表达载体，生物载体以缺陷型病毒表达载体为主，利用病毒对动物细胞的天然感染力，将目的基因表达单位成功导入宿主细胞内。螺旋神经节细胞属终末分化的神经元细胞，腺病毒是一种双链、无包膜DNA病毒，宿主范围广，可感染人体多种组织细胞，包括分裂期和非分裂期细胞（如神经细胞和心肌细胞），在基因治疗的研究中，其转染效率和安全性日益提高和完善[5-6]。本实验发现，腺病毒转染SGNs后第2 d，部分细胞胞体和突起发出荧光，提示腺病毒进入细胞内并开始表达目的基因。转染第5 d，多数细胞感染病毒并发出较强荧光。转染第11 d，部分细胞荧光转弱甚至消失，显微镜下示细胞突起变短、崩解，漂浮，不贴壁。表明腺病毒能顺利进入生长良好的SGNs细胞并在其中表达目的基因，表达时间约14 d左右，这为外源基因干预离体SGNs细胞的途径提供了一定的实验基础。

神经生长因子是一种高效多能的神经营养因子，广泛存在于动物体内，由 种亚基 按α2βγ2的排列组成，其中只有β亚基具有生物学作用。在神经元发育成熟期，具有维持感觉神经元和中枢神经元群的功能、促进成熟神经元轴索分支等作用。研究表明，NGF对神经嵴起源的耳蜗-橄榄束具有诱向和营养作用。Lefebvre等[7]观察到，外源性NGF能促进离体培养的SGNs轴突延长。Staecker等[8]认为，NGF及其受体不仅影响出生后耳蜗神经元的凋亡和神经支配的分布，而且对于防护受损神经元的变性具有一定的潜能。本实验中，在培养第72 h通过腺病毒将NGF导入SGNs，观察到转染第2 d（即培养第5 d）绿色荧光蛋白即在某些细胞中表达，发出荧光的神经元贴壁良好，轴突长，细胞的形态与非转染组比较没有明显差别。随着培养天数的增加，发出荧光的细胞数不断增多，荧光表达也逐渐增强，同对照组相比，神经元的胞体较大，轴突明显延长，许多细胞的轴突相互交织成网，提示导入SGNs中的NGF刺激了胞体和突起的生长。

Kromer[9]切断SD大鼠双侧脑中隔到背部海马的所有胆碱能神经纤维，制成脑损伤模型，然后向脑内注入NGF或细胞色素C，2 w后测定神经元存活率，结果细胞色素C组仅18%，而NGF组为84%，比对照组升高3.5倍，故认为在各种中枢神经损伤后应用外源性NGF可维持神经元生存。本实验观察了在正常培养条件下NGF对SGNs生存时间的影响，结果培养第11 d，SGNs细胞贴壁良好，形态正常；培养第14 d，转染组仍有50%SGNs发出荧光，细胞贴壁良好，细胞的形态没有明显改变，交织成网的突起也没有回缩。而非转染组中培养的SGNs在培养第10 d时即有部分细胞突起消失，胞体变形甚至死亡；培养第14 d时大多数细胞胞体已经变形，突起缩短甚至消失，多数细胞胞体内出现空泡，胞体崩解。从培养存活的时间上，可以初步推测NGF对离体培养的SGNs存活具有促进作用。

本实验将携带有NGF基因的腺病毒转染离体培养的螺旋神经节细胞，病毒成功进入细胞并表达目的基因，被转染的细胞存活时间延长，为离体SGNs的保护研究提供了一条可行的途径。

[1]池君，张学渊，宋武战.豚鼠耳蜗不同发育阶段神经生长因子的分布及其意义[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2007,42（5）:386-387.

[2]CF Dai,PS Steyger,ZM Wang,et al.Expression of Trk A receptors in the mammalian inner ear[J].Hear Res,2004,187（1）:1-11.

[3]池君，张学渊，宋武战.小鼠神经生长因子基因重组腺病毒的构建及其在基底膜上的表达 [J].中华耳科学杂志,2007,5（2）:207-211.

[4]池君,宋武战，范泉水,等.耳螺旋神经节细胞的培养及重组腺病毒在细胞中的表达[J].西南国防医药,2013,23（4）:349-351.

[5]Kamimura K,Suda T,Zhang G,et al.Advances in gene delivery systems[J].Pharmaceut Med,2011,25（5）:293-306.

[6]Nadeau I,Kamen A.Production of adenovirus vector for gene therapy[J].Biotechnol Adv,2003,20（7-8）:475-489.

[7]Lefebvre PP,Van de Water TR,Staecker H,et al.Nerve growth factor stimulates neurite regeneration but not survival of adult auditory neurons in vitro[J].Acta Otolaryngol,1992,112（2）:288-293.

[8]Staecker H,Li D,Malley BW,et al.Gene expression in the mammalian cochlea:a study of multiple vector systems[J].Acta Otolaryngology,2001,121（2）:157-163.

[9]Kromer LF.Nerve growth factor treatment after brain injury prevents neuronal death[J].Science,1987,235（4785）:214-216.