Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT通路信号分子在黑素瘤中的表达

徐玉荣，刘启方，廖文俊

Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT通路信号分子在黑素瘤中的表达

徐玉荣，刘启方，廖文俊

徐玉荣

目的 探讨Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT通路主要信号分子在正常人黑素细胞及不同黑素瘤细胞系中的激活状态。方法 选取正常人原代黑素细胞（MC）及来源于原位（WM793B）、侵袭性（LIBR）及转移性（SK-MEL-5）黑素瘤细胞系和色素痣、黑素瘤组织，采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹法(Western blot)、激光共聚焦及免疫组化法检测细胞及组织中该通路主要信号分子的表达情况。结果 与正常人黑素细胞相比，在不同黑素瘤细胞系中该通路主要信号分子Wnt5a、散乱蛋白2(DVL2)、钙调神经磷酸酶(calcineurin，CN)、活化T细胞核因子2(NFAT2)、环氧合酶-2 (COX-2)、血管内皮细胞生长因子A (VEGF-A)、黏着斑蛋白(vinculin)及波形蛋白(vimentin)明显高表达，且Ca2+浓度较高；CN-B、NFAT2在色素痣中均为阴性表达，而在黑素瘤组织中多数呈阳性表达（P＜0.001）。在侵袭性及转移性黑素瘤中的表达强度明显高于原位黑素瘤。结论 在黑素瘤的发生、发展过程中，Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT信号通路可能被激活，并在黑素瘤的侵袭和转移中发挥重要作用。

黑素瘤；钙调神经磷酸酶；活化T细胞核因子； Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT通路

恶性黑素瘤（MM）是恶性程度高、容易发生转移的皮肤恶性肿瘤，其侵袭、转移机制目前尚不完全清楚。有关Wnt5a-Ca2+信号通路与肿瘤发生、发展的关系已成为研究者关注的热点，但其在黑素瘤发展过程中的精确调控机制尚有待进一步探讨。根据文献报道及笔者试验组的前期研究，推测在黑素瘤细胞中存在一条Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT信号通路，并可能参与了黑素瘤的侵袭、转移过程。为此笔者选择正常皮肤黑素细胞及来源于不同生长期的3株黑素瘤细胞系，采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western-blot)检测该信号通路主要信号分子Wnt5a、散乱蛋白（DVL）、钙调神经磷酸酶(calcineurin，CN)、活化T细胞核因子2(NFAT2)、环氧合酶2 (COX-2)、血管内皮细胞生长因子（VEGF）、黏着斑蛋白（vinculin）、波形蛋白（vimentin）的表达水平，再用激光共聚焦扫描显微镜检测这4株细胞内的Ca2+浓度，最后用免疫组化检测色素痣及原位、侵袭性和转移性黑素瘤临床组织标本中CN-B和NFAT2的表达，以探讨Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT信号通路在不同发展期黑素瘤细胞中的激活状态。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株及组织标本 WM 793B、LIBR、SKMEL-5黑素瘤细胞为本科室储存，原代黑素细胞由正常男性包皮环切组织分离、培养获得；所有组织标本均来源于西京医院皮肤科，诊断结果均通过临床、组织病理和免疫组化证实，蜡块保存完好，临床资料齐全。其中色素痣30例，原位、侵袭和淋巴结转移黑素瘤各10例。

1.1.2 主要试剂 Dispase、254及K-SFM培养基（GIBCO），Trizol（Invitrogen公司），反转录试剂盒（TaKaRa公司），PCR引物由TaKaRa合成，RIPA裂解液及BCA法蛋白含量检测试剂盒（beyotime公司），一抗为兔抗人NFAT2抗体（cell signaling公司）及Wnt5a、CN-B、DVL2、COX-2、VEGF-A、vinculin、vimentin抗体（Abcam公司），二抗为HRP标记的羊抗兔IgG抗体（北京中山生物技术有限公司），Fluo-3/AM（Invitrogen），AEC显色试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）。

1.1.3 主要设备 RNA定量仪（BECKMAN）、凝胶成像仪（Alphalmager）、PCR仪及电泳、转膜器材（BIO-RAD）、激光共聚焦显微镜（Olympus公司）

1.2 方法

1.2.1 正常人黑素细胞分离与培养 取正常男性包皮组织，修剪掉包皮的血块和皮下脂肪，0.01 mol/L无菌PBS 冲洗3次；置75%乙醇中浸泡50 s；剪成1 cm小长条，置入dispase中，4℃消化16 h；将表皮与真皮分离，将表皮剪碎后置入0.25%胰酶（含0.02% EDTA）中，37 ℃消化 5 min，轻轻吹打5 min，加入含10%小牛血清的DMEM/F12培养液终止消化；100目细胞筛网过滤，细胞混悬液1 000 r/min离心7 min，弃上清；用含青霉素、链霉素的DMEM/F12培养基悬浮细胞，置入37 ℃、5%CO2孵箱中；2 h后弃上清，用角质细胞培养基K-SFM培养3 d，以抑制成纤维细胞生长；更换含5%胎牛血清的254培养基，以胰酶消化差速贴壁法纯化细胞，S-100蛋白、Melan-A鉴定。

1.2.2 RT-PCR 根据Trizol说明书提取4种细胞总RNA。取上述RNA溶液2 μl 稀释50倍进行定量，A260/ A280值为1.8～2.0。逆转录合成cDNA。取上述逆转录产物PCR扩增，反应体系为10 μl。反应条件为：94 ℃2 min；94 ℃ 30 s；51 ℃（CN）、54℃（DVL2）、56℃[Wnt5a、 NFAT2、COX-2、VEGF-A、vinculin、vimentin、 甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)]30 s；72 ℃ 30 s；33个循环；72 ℃ 5 min。产物用2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪观察结果。以GAPDH（21个循环）作为内参照，引物设计见表1。

表1 引物设计

1.2.3 Western blot 向大瓶内细胞加入RIPA裂解液，裂解20 min，低温离心后收集上清液，用BCA法蛋白含量检测试剂盒定量，取适量总蛋白与其1/4体积5×上样缓冲液混合后煮沸，配凝胶及电泳，转膜，用封闭液稀释一抗（1:1 000兔抗人Wnt5a、DVL2、CN-B、NFAT2、COX-2、VEGF-A、vinculin、vimentin、ß-肌动蛋白）4 ℃过夜，洗膜，用上述封闭液稀释二抗（1:3 000羊抗兔IgG抗体）室温2 h，发光。

1.2.4 正常人黑素细胞和黑素瘤细胞中的Ca2+浓度检测 常规传代，按照每孔4×104的细胞密度将4株细胞放置于激光共聚焦专用的35 mm的细胞培养皿中（皿中间孔直径为10 mm），加入培养液，培养24 h；完全贴壁生长后，加入120 µl测定液（Hank's BSS包括20 mmol/L HEPES、10 µmol/L Fluo-3/AM，pH7.4），置培养箱中孵育30 min；用Hank's BSS缓冲液轻洗细胞2次，加入1.5 ml含胎牛血清的DMEM，置培养箱中20 min； 室温避光20 min，激光共聚焦荧光显微镜观察细胞荧光，选择状态较好的细胞进行拍摄，结果由Image-Proplus6.0软件测定光密度值，采用单因素方差分析进行统计学分析，然后采用LSD法进行组间的两两比较。

1.2.5 免疫组化染色 常规脱蜡；灭活内源性过氧化物酶；煮沸修复抗原；加入正常山羊血清封闭液；滴加兔抗人一抗，湿盒中过夜；先后滴加即用型免疫组化ELIVISIONTMPLUS试剂A及B；AEC显色：棕色EP管先加入850 µl蒸馏水，再先后加入试剂A、B、C各50 µl，摇匀后加至切片室温显色，复染后AEC试剂封片。结果判定：利用Image-Pro软件检测阳性红棕色染色面积，＜10%判定为阴性，＞10%判定为阳性，同时在所有阳性标本中，按染色程度分为弱阳性及强阳性[1]。统计学处理采用SAS 9.1.3统计学软件，χ2检验。

2 结 果

2.1 RT-PCR检测结果

Wnt5a、DVL2、CN-B、NFAT2、COX-2、VEGF-A、vinculin和vimentin的mRNA在正常黑素细胞中均为低表达，而在原位、侵袭性和转移性黑素瘤中则有不同程度的高表达，但在不同生长期恶性黑素瘤细胞中并未呈现动态的变化趋势（图1）。

2.2 Western blot检测结果

内参照β-肌动蛋白相对分子质量为43 000，Wnt5a、DVL2、CN-B、NFAT2、COX-2、VEGF-A、vinculin和vimentin相对分子质量分别为41 000、93 000、19 000、140 000、78 000、27 000、117 000和57 000。在检测的4株细胞中，正常人黑素细胞均为低表达，而原位、侵袭性和转移性黑素瘤细胞的表达均显著增强，但在不同生长期黑素瘤细胞之间并未呈现出动态的变化趋势（图2）。8个信号分子在mRNA和蛋白质水平的表达均有一致性。

图1 Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT信号分子RT-PCR检测结果

图2 信号分子的Western-blot检测结果

2.3 正常黑素细胞及黑素瘤细胞中Ca2+浓度的检测与正常人黑素细胞相比，WM793B、LIBR和SK-MEL-5细胞内的荧光强度显著增加，提示黑素瘤细胞内Ca2+浓度明显增高，但未呈现出由正常皮肤黑素细胞、原位、侵袭性和转移性黑素瘤细胞内钙离子浓度逐渐增高的动态趋势（图3）。

2.4 免疫组化检测不同标本中NFAT 2和CN-B的表达NFAT 2表达于细胞核及细胞质，阳性染色为棕红色着色颗粒，色素痣中NFAT 2蛋白均为阴性表达（0/30），而不同生长期黑素瘤中NFAT 2蛋白阳性表达率为63%（19/30）（原位、侵袭性和淋巴结转移黑素瘤组织阳性例数分别为2例、8例和9例；强阳性分别为0例、6例和7例），与色素痣的阴性表达相比，两者之间差异有统计学意义（P＜0.001）（表2，图4）。而CN-B主要表达于细胞质。恶性黑素瘤中CN-B蛋白阳性表达率为67%（20/30）（原位、侵袭性和淋巴结转移黑素瘤组织阳性例数分别为3例、8例和9例；强阳性分别为0例、6例和7例），而在色素痣组织中CN-B蛋白均为阴性表达，两者之间差异有统计学意义（P＜0.001）（表2，图5）。

表2 色素痣及黑素瘤组织中NFAT2、CN-B的表达 [例(%)]

图3 激光共聚焦荧光显微镜观察细胞荧光强度

图4 免疫组化检测NFAT2表达结果（EliVision法）

图5 免疫组化检测CN-B表达结果（EliVision法）

3 讨 论

Wnt信号通路是近年来备受关注的调控胚胎发育和细胞生长、增生和凋亡的信号转导途径，非经典Wnt/Ca2+通路在恶性黑素瘤侵袭、转移中的作用则成为近年来的研究热点。NFAT是一组在哺乳动物细胞内广泛表达的转录因子，主要参与机体生长发育和复杂的细胞相互作用，可在转录水平上调控细胞周期的演进、生长和分化[2,3]。NFAT对细胞稳定具有重要调控作用，这也使其具有致癌的潜能，如在胰腺癌等多种上皮性肿瘤以及肿瘤衍生细胞内均发现异常的NFAT亚型mRNA和蛋白质表达[4,5]。NFAT的活化途径为Wnt5a蛋白与细胞表面受体复合物结合后，即触发细胞内的信号转导,活化细胞内蛋白DVL2，继而促使细胞内Ca2+浓度升高，激活CN，后者使NFAT脱磷酸化，向核转位，与特定的DNA区域相结合，调节COX-2、VEGF、vinculin和vimentin等靶基因的转录表达，促进肿瘤的发生与发展。Juhász 等[6]发现，黑素瘤细胞系中CN的活性能够被免疫抑制剂环孢素(CsA)所抑制，出现细胞代谢活性及增生率降低、细胞形态学变化、细胞内肌动蛋白结构改变，最后增加死亡率，因而推测CN在黑素瘤细胞的生物学功能方面起着较为重要的作用。Flockhart等[7]发现，NFAT2及NFAT4表达于黑素瘤细胞系，NFAT作为COX-2的上游调控基因，可调控其蛋白表达及启动子活性。笔者试验组的前期研究发现，COX-2蛋白在恶性黑素瘤细胞系中表达水平明显升高，COX-2抑制剂塞来昔布和吲哚美辛均能显著抑制恶性黑素瘤细胞的生长[8]。Wnt5a和Wnt11的基因表达水平在正常黑素细胞中表达较低，而在黑素瘤细胞中有不同程度的升高。利用钙离子成像技术发现卡巴胆碱对正常黑素细胞内的钙离子浓度没有显著影响，而不同生长阶段的黑素瘤细胞中钙离子浓度显著升高[9]。根据文献报道及笔者前期研究，推测在恶性黑素瘤细胞中可能存在一条Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT信号通路，该通路的激活可能参与了黑素瘤的侵袭、转移过程。为此，笔者首先对不同生长期的黑素瘤细胞中Wnt5a、DVL2、CN、NFAT2、COX-2、VEGF-A、vinculin和vimentin 8个信号分子的mRNA及蛋白质表达进行了检测，结果为高表达，提示Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT信号通路在黑素瘤细胞中被激活。随后应用激光共聚焦扫描显微镜技术对该通路中的重要环节——钙离子浓度进行了检测，发现正常黑素细胞中Ca2+浓度较低，但在3株黑素瘤细胞中明显增高，但信号分子的表达水平和Ca2+浓度在3株黑素瘤细胞之间并未呈现出逐渐增强的动态变化趋势，考虑可能选择的是体外培养的黑素瘤细胞系，而且经过长期的传代培养，细胞系的某些生物学性状可能会发生改变。为验证Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT信号通路在黑素瘤活体组织中是否被激活及其与肿瘤发展过程的关系，又采用免疫组化对黑素瘤临床标本中的CN-B和NFAT2进行了检测，结果显示色素痣中均为阴性表达，而在黑素瘤组织中CN-B和NFAT2多数呈阳性表达，且侵袭性及转移性黑素瘤组织中的阳性表达率及表达强度明显高于原位黑素瘤组织。笔者认为，在黑素瘤的发生、发展过程中，Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT信号通路可能被激活，并可能参与了黑素瘤的侵袭和转移过程。

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The expression of signaling molecules of Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT pathway in melanoma

XU Yu-rong，LIU Qi-fang，LIAO Wen-jun
Department of Dermatology, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China

Objective To investigate the expression of main signaling molecules of Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT signaling pathway in normal melanocytes and melanoma cells. Methods Expression of main signaling molecules was detected by laser confocal, immunohistochemistry, RT-PCR and Western blot in primary cultured melanocytes from healthy persons, WM793B, Libr, Sk-mel-5 melanoma cells, pigmented nevus and melanoma tissue. Results The expression of Wnt5a, DVL2, calcineurin, NFAT2, COX-2, VEGF-A, Vinculin and Vimentin was significantly higher in melanoma cells than in normal melanocytes. The result of Ca2+concentration was similar to the expression of those molecules. The expression of calcineurin-B and NFAT2 was positive in most melanoma tissues but negative in pigmented nevus (P＜0.001). The expression intensity of calcineurin-B and NFAT2 was significantly higher in invasive melanoma and metastatic melanoma than in melanoma in situ. Conclusion The Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT signaling pathway may be activated in melanoma and play a key role in invasion and metastasis of melanoma.

Melanoma；Calcineurin；Nuclear factor of activated T-cells；Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT pathway [J Pract Dermatol, 2015, 8(6):406-410]

R739.5

A

1674-1293(2015)06-0406-05

2015-06-28

2015-07-30）

（本文编辑 耿建丽）

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20150602

710032 西安，第四军医大学西京皮肤医院（徐玉荣，刘启方，廖文俊）

徐玉荣，硕士研究生，主治医师，研究方向：黑素瘤，E-mail: 1240496856@qq.com

廖文俊，E-mail: liaowj@fmmu.edu.cn