脂联素通过激活PP2A减轻H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤及tau蛋白过度磷酸化*

宋哲，薛超，张小曼，张叶敏，何小华，尹君

(武汉大学基础医学院，湖北 武汉 430071)

脂联素通过激活PP2A减轻H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤及tau蛋白过度磷酸化*

宋哲，薛超，张小曼，张叶敏，何小华△，尹君△

(武汉大学基础医学院，湖北 武汉 430071)

目的:观察脂联素(adiponectin)对H2O2诱导的人神经母细胞瘤SH－SY5Y细胞活力及tau蛋白磷酸化的影响并探讨其作用机制。方法:采用MTT法并观察细胞形态，检测脂联素对H2O2诱导的SH－SY5Y细胞活力损伤的影响;应用Western blotting观察脂联素对tau蛋白磷酸化及蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)和糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase－3β，GSK－3β)活性的影响。结果:脂联素减轻了H2O2诱导的SH－SY5Y细胞损伤(P＜0.01)。脂联素上调了H2O2诱导的SH－SY5Y细胞的PP2A活性，明显减轻此时tau的异常过度磷酸化(P＜0.01)。PP2A抑制剂冈田酸阻断了脂联素的保护作用(P＜0.01)。脂联素同时使H2O2诱导的SH－SY5Y细胞的GSK－3β磷酸化水平上升(P＜0.01)。结论:脂联素减轻H2O2诱导的SH－SY5Y细胞损伤及tau蛋白异常过度磷酸化，其机制可能与激活PP2A并抑制GSK－3β信号途径有关。

脂联素;过氧化氢;蛋白磷酸酶2A;糖原合酶激酶－3β;Tau蛋白

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是最常见的中枢神经系统退行性疾病之一，主要表现为进行性记忆丧失和认知障碍［1］。AD的主要病理学特征为患者脑内神经原纤维缠结(neurofibrilary tangle，NFT)、大量老年斑(senile plaque，SP)和神经元丢失等。NFT位于神经细胞内，由异常过度磷酸化的微管相关蛋白tau相互缠结形成。Tau异常过度磷酸化的机制并不完全清楚，相当多证据表明可能与脑部蛋白激酶(protein kinases，PK)和蛋白磷酸酶(protein phosphatases，PPs)的活性改变有关［2］，其中较为重要的有糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase－3β，GSK－3β)和蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase2A，PP2A)。AD患者脑中GSK－3β活性增强［3］，以及PP2A活性抑制［4］可使tau蛋白的磷酸化水平显著升高［5］，促进AD的发生。

脂联素(adiponectin，Adipo)是机体重要的细胞因子，主要由脂肪组织分泌，具有抗炎、抗氧化和调节胰岛素敏感性等功能［6］。在外周组织中，脂联素对高血压、动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝和2型糖尿病等有改善作用［6］。脂联素是胰岛素的增敏因子，能够增加磷脂酰肌醇3－激酶(phosphatidylinositol 3－kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)的活性［7］，Akt作为GSK－3β的上游激酶，使GSK－3β的Ser9位点磷酸化而活性下降。脂联素也可以影响PP2A的活性，在乳腺癌细胞中，脂联素通过AMP活化蛋白激酶(AMP－activated protein kinase，AMPK)途径激活PP2A从而降低肿瘤的侵袭性［8］。脂联素在中枢神经系统中具有一定作用，它不仅调节下丘脑摄食中枢［9］，影响中心体温和能量代谢［10］，还能够减轻卡因酸诱导的细胞毒性［11］。报道显示，AD患者往往有内分泌的改变，血浆中脂联素含量异常［12］，但脂联素在中枢神经系统中的作用尚不清楚。本文通过观察脂联素对H2O2诱导的神经细胞损伤及tau蛋白过度磷酸化的影响，探讨了脂联素对AD的影响及其机制。

材料和方法

1 主要试剂和仪器

脂联素由美国德克萨斯大学健康科学中心Lily Q.Dong教授惠赠。PP2A、p－GSK－3β(Ser9)和p－tau (Ser396)抗体购于Cell Signaling;GSK－3β抗体购于Signalway Antibody LLC;p－tau(Ser404)抗体购于Santa Cruz;tau－5、p－PP2A(Tyr307)和β－actin抗体购于Abcam;辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的Ⅱ抗、增强化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)试剂盒和BCA蛋白检测试剂盒购于Pierce;DMEM细胞培养液和胎牛血清购自Hyclone;MTT粉剂(Biosharp);H2O2溶液(国药集团);二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)购于上海申工，其它试剂购于Sigma。

Western blotting设备(Bio－Rad);SW－CJ系列超净工作台(江苏安泰空气技术有限公司);CO2培养箱(Forma);倒置显微镜(Nikon);多功能酶标仪(BioTek)。

2 方法

2.1 SH－SY5Y细胞培养人神经母细胞瘤SHSY5Y细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液内，置于37℃、饱和湿度、5%CO2条件下培养。

2.2 实验分组为研究H2O2对细胞的损伤作用，给予细胞不同浓度H2O2处理1 h后检测细胞活力，确定后续实验中H2O2的浓度。为了研究脂联素的保护作用，细胞分为对照组、脂联素组、H2O2组和H2O2+脂联素组。在H2O2(200 μmol/L)处理40 min后，给予脂联素(2 mg/L)与H2O2共同作用20 min，进行MTT检测、细胞形态学观察及Western blotting检测。冈田酸(okadaic acid，OA)抑制实验中，细胞分为H2O2处理组、脂联素+H2O2组、OA+ H2O2组和脂联素+OA+H2O2组。细胞给予1 nmol/L OA预处理1 h后，在加入H2O2和脂联素共同作用。实验至少重复3次。

2.3 细胞活力的检测细胞活力采用MTT法进行测定。细胞接种于96孔细胞培养板，接种密度为5×103/L，每孔培养液体积为100 μL，每组设定6个平行孔。细胞培养液中加入不同浓度(0、100、200、400和600 μmol/L)的H2O2，37℃作用1 h。每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，继续培养4 h。弃培养液，每孔加入150 μL DMSO，轻摇10 min，多功能酶标仪490 nm波长下测定吸光度(absorbance，A)。

2.4 Western blotting检测蛋白水平细胞处理结束后用预冷的1×PBS洗2次，6孔板每孔加入含磷酸酶抑制剂的RIPA buffer裂解细胞，12 000×g离心10 min，获取上清。BCA法测定细胞蛋白浓度后，行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白转膜后，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，1×TBST洗膜，I抗4℃孵育过夜。洗膜，加入HRP标记的Ⅱ抗，室温孵育1 h。洗膜后ECL显色。胶片扫描并用ImageJ图像分析系统进行灰度分析。

3 统计学处理

采用GraphPad Prism统计软件处理。数据以均数±标准误(mean±SEM)表示，组间比较并采用单因素方差分析(one－way ANOVA)及LSD－t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 不同浓度H2O2对SH-SY5Y细胞活力的影响

H2O2诱导了SH－SY5Y细胞的急性损伤。不同浓度(0、100、200、400和600 μmol/L)的H2O2作用于SH－SY5Y细胞1 h，MTT法测定细胞活力，结果见图1。在100 μmol/L H2O2处理时，细胞活力有所下降，但没统计学差异(P＞0.05)。给予更高浓度H2O2处理，细胞活力显著下降且呈剂量依赖性，200、400和600 μmol/L组的细胞活力分别是对照组的83.9%、47.8%和31.3%，差异有统计学意义(P＜0.01)。因200 μmol/L是使细胞活力下降的最低浓度，所以后续实验中所用H2O2浓度均为200 μmol/L。

Figure 1.The viability of SH－SY5Y cells incubated with H2O2at different concentrations.Mean±SEM.n=3.＊＊P＜0.01 vs 0 μmol/L group.图1 不同浓度H2O2对SH-SY5Y细胞活力的影响

2 脂联素对H2O2诱导细胞损伤的保护作用

给予SH－SY5Y细胞200 μmol/L H2O2处理40 min后，加入2 mg/L脂联素与H2O2共同作用20 min，MTT法检测细胞活力，显微镜下观察细胞形态。与对照组相比，H2O2处理组的细胞活力显著下降(P＜0.01)。给予脂联素后，H2O2的损伤作用被抑制，细胞活力由损伤时的81.5%升高到95.8%(P＜0.01)，基本恢复正常。与对照组相比，单独应用脂联素对细胞活力没有明显影响(P＞0.05)。在100倍显微镜下，各组细胞外形完好，突起正常，形状无明显差异，见图2。上述结果说明脂联素能减轻H2O2诱导的细胞损伤。

3 脂联素降低H2O2诱导的tau蛋白异常过度磷酸化

SH－SY5Y细胞在H2O2作用下给予脂联素处理，检测细胞内tau蛋白的Ser396和Ser404位点磷酸化及总tau蛋白(tau－5)水平的变化，β－actin作为内参照。结果显示，与对照组相比，H2O2处理组的tau蛋白在Ser396和Ser404位点的磷酸化水平显著上升(P＜0.01)，给予脂联素后，tau蛋白的磷酸化水平下降，有统计学差异(P＜0.05)。总tau蛋白在组间无差异，单独给予脂联素对tau蛋白的磷酸化水平无明显影响(P＞0.05)，见图3。

4 脂联素对PP2A活性的影响

与对照组相比，H2O2处理组PP2A的Tyr307位点磷酸化(非活性形式)水平明显增高，导致PP2A活性下降(P＜0.01);给予脂联素后，PP2A的Tyr307磷酸化水平明显降低，活性升高(P＜0.01);单独给予脂联素时，PP2A的总量及磷酸化水平无明显改变(P＞0.05)，见图4。上述结果说明H2O2通过抑制PP2A活性使tau蛋白异常过度磷酸化，而脂联素可以通过增加PP2A活性减轻H2O2诱导的tau蛋白过度磷酸化。

5 PP2A抑制剂OA对脂联素保护作用的影响

SH－SY5Y细胞预先给予PP2A抑制剂OA(1 nmol/L)处理1 h，随后加入H2O2和(或)脂联素后提取蛋白，检测tau蛋白的总量和磷酸化水平。结果显示，与H2O2组相比较，脂联素+H2O2组的p－tau Ser396显著降低(P＜0.01)。如预先给予OA，脂联素降低tau蛋白磷酸化的作用明显减弱，p－tau Ser396上升(P＜0.01)，且与OA+H2O2组比较无显著差异(P＞0.05)，见图5。上述结果说明脂联素主要是通过激活PP2A来降低H2O2诱导的tau蛋白过度磷酸化。

Figure 3.The effects of adiponectin(Adipo)on H2O2－induced hyperphosphorylation of tau in the SH－SY5Y cells.Mean±SEM.n=3.＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs H2O2.图3 脂联素降低H2O2诱导的tau蛋白异常过度磷酸化

Figure 4.The effects of adiponectin(Adipo)on PP2A activity in the SH－SY5Y cells.Mean±SEM.n=3.＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs H2O2.图4 脂联素对PP2A活性的影响

Figure 5.The effects of PP2A inhibitor OA on the cytoprotective function of adiponectin(Adipo).Mean±SEM.n=3.＊＊P＜0.01 vs H2O2;##P＜0.01 vs Adipo+ H2O2.图5 PP2A抑制剂OA对脂联素保护作用的影响

6 脂联素对GSK-3β磷酸化的影响

H2O2组GSK－3β的Ser9位点磷酸化(非活性形式)水平增高，为对照组的119.6%(P＜0.05);继续给予脂联素后p－GSK－3β Ser9增加至对照组的175.2%(P＜0.01);单独给予脂联素组GSK－3β的磷酸化水平无明显改变(P＞0.05)，GSK－3β的总量在组间无显著差异，见图6。

Figure 6.The effects of adiponectin(Adipo)on the phosphorylation level of GSK－3β in the SH－SY5Y cells.Mean± SEM.n=3.*P＜0.05 vs control;##P＜0.01 vs H2O2.图6 脂联素对GSK-3β磷酸化的影响

讨论

AD是老年人最常见的痴呆类型，发病机制不甚明确。目前认为AD由多因素引起，并提出了多种假说，包括异常蛋白聚积学说，Aβ级联反应学说，氧化应激学说及细胞凋亡学说等。越来越多的资料证明，氧化应激作为可能的触发因素，与其它机制相互作用。在AD早期，患者出现临床症状之前就存在氧化损伤［13］。氧化应激还参与了AD特征性病理学改变NFT的形成及神经元凋亡［14］。本实验采用H2O2处理细胞，模拟机体的氧化应激状态，发现神经细胞出现活力降低及tau异常过度磷酸化的表现，这与其它文献在人胚肾HEK293/tau细胞上的研究结果类似［15］。

脂联素作为外周重要的脂肪因子，对体内多条信号途径有调节作用。脂联素能够增加人乳腺癌MDA－MB－231细胞中PP2A的活性，抑制肿瘤的转移［8］。我们研究发现，SH－SY5Y细胞在H2O2存在的条件下，脂联素能明显激活PP2A;在没有H2O2的条件下，脂联素对PP2A活性的影响则不明显。上述表现和乳腺癌细胞中即使无外界刺激脂联素仍能激活PP2A的表现不甚一致［8］，可能是外周组织细胞与中枢神经细胞对脂联素反应性不同所造成。PP2A的激活使tau去磷酸化，我们的研究发现，预先给予OA阻断PP2A时，脂联素降低tau磷酸化水平的作用消失，说明脂联素在很大程度上通过PP2A途径起作用。

Tau蛋白的磷酸化水平也受蛋白激酶调控［16］。其它小组研究发现，在H2O2作用下，HEK293/tau细胞的p－GSK－3β(Ser9)(非活性形式)水平增高，其作者认为此时GSK－3β存在被切割的情况，GSK－3β活性仍然上升［15］。另一研究也发现大鼠原代皮层神经元在H2O2作用下p－GSK－3β(Ser9)水平增高，作者认为是代偿反应［17］。我们研究发现，尽管在H2O2作用下SH－SY5Y细胞的p－GSK－3β(Ser9)水平增高，然而此时tau蛋白呈现出过度磷酸化状态，可以推测此时tau蛋白的过度磷酸化主要由PP2A活性下降引起，而GSK－3β活性是否变化需要进一步研究。脂联素在H2O2刺激条件下使p－GSK－3β(Ser9)明显上升，可能是脂联素激活了PI3K/Akt途径，这在大鼠心肌细胞上有类似表现［18］。与我们发现的PP2A结果类似，无H2O2存在时脂联素对GSK－3β活性影响不大，说明脂联素的保护作用主要体现在机体受损的状态下，这为AD的防治提供了新思路。

细胞内活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)不断生成和清除，当氧化作用超过了抗氧化作用时，氧化应激就会发生。脂联素在外周组织中具有抗氧化特性，如在人肾小球系膜细胞中给予脂联素能降低ROS保护机体［19］。在我们的研究中，脂联素同样可能是通过降低ROS来增加细胞活力并减轻tau的过度磷酸化。

总之，本研究证实脂联素对H2O2诱导的神经细胞损伤及tau蛋白过度磷酸化具有抑制作用，其机制可能与激活PP2A和抑制GSK－3β信号途径有关。本研究为脂联素在中枢神经系统疾病尤其是神经退行性疾病的临床应用提供了新的依据。

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Adiponectin attenuates H2O2-induced SH-SY5Y cell injury and tau hyperphosphorylation via activating PP2A

SONG Zhe，XUE Chao，ZHANG Xiao－man，ZHANG Ye－min，HE Xiao－hua，YIN Jun

(School of Basic Medical Sciences，Wuhan University，Wuhan 430071，China.E-mail:hexiaohua@whu.edu.cn;yinjun@ whu.edu.cn)

AIM:To study the effects of adiponectin on H2O2－induced cell injury and tau hyperphosphorylation in human neuroblastoma SH－SY5Y cells.METHODS:Cell viability was determined by MTT assay.H2O2－induced cell injury and morphological changes in the SH－SY5Y cells with or without adiponectin treatment were observed.The level of tau phosphorylation as well as the activities of protein phosphatase 2A(PP2A)and of glycogen synthase kinase－3β(GSK－3β) were examined by Western blotting.RESULTS:Adiponectin significantly attenuated H2O2－induced cell injury (P＜0.01).Adiponectin upregulated the activity of PP2A and decreased phosphorylation levels of tau under the stimulation with H2O2(P＜0.01).Okadaic acid，a specific inhibitor of PP2A，blocked the protective effects of adiponectin(P＜0.01).Adiponectin increased the phosphorylation level of GSK－3β at Ser9 site under H2O2stimulation(P＜0.01).CONCLUSION:Adiponectin protects SH－SY5Y cells against H2O2－induced cell injury and decreases tau hyperphosphorylation by activating PP2A and inactivating GSK－3β.

Adiponectin;Hydrogen peroxide;Protein phosphatase 2A;Glycogen synthase kinase－3β;Tau proteins

R363

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.003

1000－4718(2015)02－207－06

2014－10－31

2015－01－08

国家自然科学基金资助项目(No.81100594);教育部博士点基金资助项目(No.20100141120057)

△通讯作者何小华Tel:027－68759991;E－mail:hexiaohua@whu.edu.cn;尹君Tel:027－68759846;E－mail:yinjun@whu.edu.cn