硫辛酸对LPS诱导的帕金森病小鼠黑质多巴胺能神经元损伤的影响*

李艳花，和青，尉杰忠，刘春云，黄建军，丰玲，柴智，王青，肖保国△，马存根，△

(1山西大同大学脑科学研究所，山西 大同 037009;2复旦大学华山医院神经病学研究所，上海 200025;3同煤集团总医院神经外科，山西 大同 037003;4山西中医学院“2011”协同创新中心，卫生部临床重点专科，山西 太原 030024)

硫辛酸对LPS诱导的帕金森病小鼠黑质多巴胺能神经元损伤的影响*

李艳花1，和青2，尉杰忠1，刘春云1，黄建军3，丰玲1，柴智4，王青4，肖保国2△，马存根1，4△

(1山西大同大学脑科学研究所，山西 大同 037009;2复旦大学华山医院神经病学研究所，上海 200025;3同煤集团总医院神经外科，山西 大同 037003;4山西中医学院“2011”协同创新中心，卫生部临床重点专科，山西 太原 030024)

目的:探讨硫辛酸(LA)对脂多糖(LPS)诱导的帕金森病(PD)模型小鼠黑质多巴胺(DA)能神经元损伤的作用及机制。方法:10月龄雌性C57BL/6小鼠，随机分为生理盐水对照组、PD模型组和LA干预组。采用鼻腔滴入LPS制作PD小鼠模型，通过爬竿实验及酪氨酸羟化酶和p－NF－κB/p65的免疫组化技术观察LA对DA能神经元的保护作用。结果:LPS经鼻可以成功诱导小鼠PD模型，给予LA可明显恢复小鼠运动，减少黑质DA能神经元的丢失、抑制小胶质细胞及其NF－κB信号通路激活。结论:LA干预可缓解LPS经鼻诱导的小鼠PD行为学和病理学的改变，其作用机制可能与抑制脑内的炎症反应有关。

脂多糖;帕金森病;硫辛酸;小胶质细胞

帕金森病(Parkinson disease，PD)是仅次于阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)的第2大神经变性疾病，55岁以上人群中发病率高达1%，在全世界范围内有大约650万患者。近年来，人们发现脑内小胶质细胞(microglia，MG)的炎症反应与PD之间存在着重要联系［1］。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)为革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分，是常用的促炎症反应物质，可以激活小胶质细胞［2］。前期研究发现LPS可以通过多种途径制备PD模型:如黑质内注射、体循环注射、子宫内注射以及苍白球内注射等途径，这些途径均可以引起黑质多巴胺(dopamine，DA)能神经元的丢失［3］。硫辛酸(lipoic acid，LA)是存在于线粒体α－酮酸氧化脱氢酶系中一个重要的辅助因子，作为强而有效的抗氧化剂被广泛使用，主要通过清除体内的氧自由基和动员机体内源性的抗氧化剂的生成发挥作用［4－5］。除此之外，近几年发现，LA也兼具抗炎和神经保护作用，能明显抑制LPS诱导的NF－κB信号通路的激活，保护DA能神经元抵抗鱼藤酮诱导的损伤［6］，保护神经元抵抗低氧、谷氨酸盐和金属离子诱导的损伤［7］，保护皮层神经元抵抗β－淀粉样蛋白和H2O2诱导的损伤［8］。但LA在LPS诱导的PD炎症模型中的作用及其机制仍不清楚。

材料和方法

1 实验动物及模型制备

健康雌性C57BL/6小鼠，10月龄，体重22～25 g，由北京维通利华动物有限公司提供，清洁级饲养，自由饮食1周。乙醚麻醉小鼠约10 s后，手持其颈部，鼻孔向上，使用微量移液器将LPS(1 g/L，溶解在生理盐水中)缓慢滴入小鼠的鼻孔内，并停留一会儿(大约10 s)，使药液充分渗入，每侧鼻孔10 μL。每天给予1次，持续1个月。对照组滴入相同体积的生理盐水［9］。

2 动物分组及LA干预

用生理盐水将LA配制成10 g/L，在滴注LPS后的第3天开始给予，持续给药至30 d。24只小鼠随机分为①生理盐水对照组saline组:鼻腔滴注生理盐水;②PD模型组(LPS组):鼻腔滴注LPS;③LA治疗组(LPS+LA组):鼻腔给予LPS，3 d后同时双侧鼻腔各给予10 μL的LA。

3 行为学观察和标本采集

给药27 d时，动物进行行为学实验，用爬竿实验来评价动物运动协调性。将一个直径为1 cm，长为58 cm的木杆缠绕两层纱布，顶端固定一个方形木塞。持小鼠尾部将其放于木塞，头部朝下，让其自然下爬，记录小鼠在木塞上转头的时间和从竿顶爬至竿底平台的时间。正式测试之前，预先练习5次，然后测试3次，每次测试时间不超过3 min，超过3 min，以3 min记录。连续测试3 d。

行为学实验之后，每只腹腔注射50 mg/L水合氯醛0.2 mL，生理盐水灌流。冰上解剖，每组4只分离黑质，制备蛋白质匀浆，－70℃保存。其余4只用4%多聚甲醛灌注固定后，快速取脑组织，用OCT包埋制作冰冻切片(10 μm)，用于免疫荧光染色。

4 免疫荧光染色

取黑质区脑组织切片，PBS洗3次，每次5 min，分别用稀释于1%BSA－PBS溶液中的抗酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)抗体(Millipore)、抗CD11b抗体(eBioscience)、抗磷酸化(phosphorylated，p)－NF－κB/p65抗体(Cell signaling)4℃孵育过夜，PBS洗3次，每次5 min，再加入相应的II抗，室温孵育1.5 h，PBS洗3次，50%甘油封片。用Olympus正置荧光显微镜观察各种抗体的免疫染色活性并摄片。

5 Western blotting

上述蛋白质匀浆用BCA试剂盒检测浓度，将浓度均调成10 g/L。每种蛋白样品上样80 μg，SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳1.5～2.0 h。200 mA、1.5 h将蛋白质转移到PVDF膜上，加入抗TH抗体，4℃孵育过夜，PBST(含0.3%吐温的PBS溶液)洗3次，每次5 min，加入辣根过氧化物酶标记的IgG抗体室温下孵育1.5 h，PBST洗3次;ECL(Life Sciences)显影，Bio－Rad化学发光仪采集发光信号，Image 4.0进行灰度处理。

6 统计学处理

所有实验均重复至少3次，数据采用均数±标准差(mean±SD)表示，使用Graphpad Prism 5(Cabit Information Technology)，采用t检验对实验数据进行统计分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。每个脑组织的黑质区脑片分别选取第5张、25张、50张和75张行TH抗体免疫荧光染色，使用IMAGE－PRO PLUS软件对TH细胞进行连续计数，总数被用作统计分析。

结果

1 LA改善LPS诱导的PD模型小鼠的运动功能

在模型制备的第27天，3组动物行爬竿实验，分别记录爬竿时间和在竿顶转头的时间。结果显示鼻腔给予LPS的小鼠从竿顶爬到地面平台所需时间为(12.14±5.13)s，在竿顶转头的时间为(6.82± 3.25)s。然而生理盐水对照组小鼠所需时间分别为(9.52±2.55)s、(2.23±1.30)s，2组之间差异明显，说明LPS明显损害了小鼠的运动协调功能。LA治疗明显减少了小鼠到达平台所需的时间和竿顶转头的时间(P＜0.05)，说明LA能明显改善LPS诱导的PD模型鼠的运动功能，见图1。

Figure 1.LA improved the behavior symptoms of LPS－induced PD mice.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs LPS group.图1 LA改善LPS诱导的PD模型小鼠的运动功能

2 LA保护黑质区TH神经元免受LPS损伤

黑质区TH免疫荧光染色结果表明，3组小鼠黑质均检测到TH阳性DA能神经元，对照组TH阳性DA能神经元数量较多，胞体饱满，边缘清晰;然而LPS诱导的PD模型组TH阳性DA神经元数量较对照组明显减少(P＜0.01)，胞体轮廓模糊;LA组黑质TH阳性神经元数量与PD组相比明显增加(P＜0.05)，神经元形态清晰，与生理盐水对照组相似，见图2。

Figure 2.LA prevented TH－positive dopaminergic neurons in the substantia nigra(SN)from LPS－induced injury.A:immunohistochemistry of TH－positive dopaminergic neurons in the SN of mice，and quantitative analysis was done;B:Western blotting analyses of TH in protein extracts from the brain in mice，with the results expressed as the ratio of TH/GAPDH.Mean± SD.n=8.*P＜0.05 vs LPS group.图2 LA保护黑质区TH神经元免受LPS诱导的损伤

3 LPS诱导NF-κB信号通路的活化

在LPS给予0 d、7 d、14 d、21 d和30 d分别处死4只小鼠，制作黑质区脑组织切片，行p－NF－κB/ p65免疫荧光染色，结果显示:在0 d、7 d和14 d的小鼠黑质区仅有零星的p－NF－κB/p65染色阳性细胞，而在21 d和30 d的小鼠脑组织中，则有大量的p－NF－κB/p65染色阳性细胞，并与第0天处死的小鼠脑组织中p－NF－κB/p65阳性细胞数相比具有显著差异，说明LPS可能在第14天～21天期间激活了脑内NF－κB信号通路，见图3。

Figure 3.NF－κB signal pathway was activated on day 14～21 after LPS treatment in brain of mice.A:representative microphotographs for expression of p－NF－κB/p65 in the substantia nigra(SN)of mice;B:quantative analysis of p－NF－κB/p65 positive cells in the SN of mice.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs 0 d.图3 LPS在第14～21天时诱导小鼠脑组织NF-κB信号通路的活化

4 LA抑制小胶质细胞的NF-κB信号通路激活

采用MG特异性抗体行脑片黑质区免疫荧光染色，结果显示:生理盐水对照组MG为分枝样，突起细小，无明显胞体，染色较浅，说明该组MG处于静息状态。然而，LPS诱导的PD模型组大量的MG表现为胞体变圆，突起增粗，分枝增多，染色较深等特点，暗示该组SN区的MG呈激活态。给予LA治疗的小鼠，其SN区的MG与对照组相似，也处于静息状态。由此可见，LA可以抑制LPS诱导的MG激活。进一步用p－NF－κB/p65的抗体标记上述脑片发现，LPS诱导的PD模型组有大量的MG表达p－NF－κB/p65，而对照组和治疗组则几乎没有p－NF－κB/ p65表达，说明LA可以抑制MG的NF－κB信号蛋白的激活与表达，见图4。

讨论

PD是以进行性黑质部DA能神经元减少为特征的神经变性疾病，主要表现为运动障碍，确切发病机制至今未明［9］。因此，一种理想的可以模拟PD临床和病理特征的动物模型对于研究PD的发病机制和治疗干预显得非常重要。目前，常用的PD动物模型主要是一些神经毒物模型，用于引发PD的神经毒物主要包括6－OHDA、MPTP、百草枯、鱼藤酮等［3］。然而，这些物质诱导的PD模型均有局限性，如6－OHDA必须要脑内定向注射，MPTP自然界并不存在，成模率不稳定，毒性大。另外，这些神经毒物的人工暴露路径可能也不是PD患者致病的真实途径。目前认为PD环境毒物暴露可能包括口服和经鼻2个途径［3］。LPS在自然界中普遍存在，包括空气中的尘埃、细颗粒物(particulate matter，PM)等污染物，有可能经鼻避开血脑屏障(blood brain barrier，BBB)直接进入脑内诱导PD的发生。有研究表明，在脑室内注射大剂量LPS，1 h之后就有小胶质细胞激活，24 h后部分小胶质细胞进一步激活成“阿米巴样”，黑质部可见一些圆形的胶质细胞［10－11］，说明LPS能通过激活中枢炎症反应而导致PD的发生，但是这种立体定向注射技术操作难度较大，一次性给予LPS(100 μg)的浓度太高，并不能真正模拟正常的慢性炎性病理状态，限制了该LPS诱导的PD模型的广泛应用。也有人通过腹腔注射LPS(5 mg/kg)成功诱导PD模型［12－13］，但是腹腔注射可引发炎症反应以及随后的体液免疫反应和肝肾功能的损害。Tonelli等［14］已证实经鼻暴露LPS能激活嗅觉上皮细胞内的炎症反应，同时还导致嗅觉神经元的丢失，这一现象可能可以用来解释早期PD患者嗅觉减退的临床症状。鼻炎增加PD的发病风险，也可能与鼻炎的感染源释放了过多的LPS相关，这些研究结果提示鼻腔LPS暴露途径可能是一个合理制备PD模型的方法［3］。2013年，有学者通过LPS经鼻暴露成功制备了PD模型，本研究采用LPS长时间、低剂量滴鼻持续给予C57BL/6小鼠成功获得了理想的PD动物模型［3，9］。结果显示鼻腔滴入LPS可以诱导小鼠运动功能改变，引发黑质多巴胺能神经元的丢失、激活小胶质细胞及其NF－κB信号通路，而且还发现持续给予LPS至14～21 d时就能明显地激活NF－κB信号通路。

在哺乳动物体内，LA是线粒体α－酮酸氧化脱氢酶的一个辅助因子，通过清除体内的氧自由基和动员机体内源性的抗氧化剂的生成发挥作用［15］。具有水溶性、脂溶性和分子量小等特点，能容易地通过BBB［16］。最近研究发现LA兼具有抗炎和神经保护作用，能明显抑制LPS诱导的NF－κB信号通路的激活，保护皮层神经元抵抗β－淀粉样蛋白和H2O2的损伤［8］。膳食中补充LA可以抑制IL－6和TNF－α的表达［17］。通过抑制LPS对NF－κB和AP－1信号蛋白的激活，下调LPS诱导的NO和TNF－α的产生［18］。体外BV－2细胞实验也显示，LA通过抑制GSK－3β、PI3K和激活Akt信号通路来抑制LPS诱导的炎症反应［19］。LA具有保护PC12神经元免受MPTP毒性损害的作用［20］。上述研究人员主要是通过体外实验发现了LA能够明显抑制刺激物诱导的炎症反应及神经损伤，然而并未有研究人员从体内探讨LA的神经保护作用，因此本研究利用LPS经鼻诱导的小鼠PD模型，采用免疫荧光染色及Western blotting技术检测了黑质TH数量，CD11b阳性小胶质细胞形态和p－NF－κB蛋白的表达情况，并结合爬竿实验，探讨了LA对LPS所致小鼠黑质DA能神经元损伤的保护作用和机制。结果显示，与PD组相比，LA可明显恢复小鼠运动，减少黑质多巴胺能神经元的丢失、抑制小胶质细胞及其NF－κB信号通路激活，提示LA对LPS诱导的黑质DA能神经元损伤具有保护作用，体内实验结果与体外实验结果相似。

综上所述，我们推测LA干预可能是通过抑制NF－κB活性，抑制小胶质细胞的激活，缓解LPS经鼻引起的小鼠PD行为学和病理学的改变。

Figure 4.LA significantly inhibited NF－κB activation in microglia.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs LPS group.图4 LA抑制小胶质细胞NF-κB信号通路激活

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Lipoic acid protects dopaminergic neurons in LPS-induced model of Parkinson's disease

LI Yan－hua1，HE Qing2，YU Jie－zhong1，LIU Chun－yun1，HUANG Jian－jun3，FENG Ling1，CHAI Zhi4，WANG Qing4，XIAO Bao－guo2，MA Cun－gen1，4

(1Department of Neurology，Institute of Brain Science，Medical School，Shanxi Datong University，Datong 037009，China;2Institute of Neurology，Huashan Hospital，Institutes of Brain Science and State Key Laboratory of Medical Neurobiology，Fudan University，Shanghai 200025，China;3Department of Neurosurgery，First Hospital，Datong Coalmine Group，Datong 037003，China;4"2011"Collaborative Innovation Center/Department of Encephalopathy and National Major Clinical Department of Ministry of Health，Shanxi University of Traditional Chinese Medicine，Taiyuan 030024，China.E-mail:macungen2001@163.com)

AIM:To evaluate the effect of lipoic acid(LA)on LPS－induced Parkinson disease(PD)model of mice.METHODS:Female C57BL/6 mice of 10－month－old were randomly divided into saline control group，PD group and LA group.The PD mouse model was induced by intranasal instillation of LPS.Assays of tyrosine hydroxylase，microglia and nuclear factor kappa B(NF－κB)were performed by the methods of immunohistochemistry and Western blotting.RESULTS:Intranasal LPS instillation exhibited basic characteristics of PD model.However，LA administration significantly improved motor dysfunction，protected dopaminergic neurons from damage，and inhibited NF－κB activation in inflammatory microglia in the substantia nigra area of the brain.CONCLUSION:LA may exert a profound neuroprotective effect by anti－neuroinflammatory reaction to arrest the progression of PD.

Lipopolysaccharide;Parkinson disease;Lipoic acid;Microglia

R363

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.002

1000－4718(2015)02－201－06

2014－09－11

2014－10－12

国家自然科学基金资助项目(No.81272163);山西省青年自然科学基金资助项目(No.2012021034－2);山西大同大学博士科研启动经费(No.2011－B－11);山西大同大学研究所科研项目启动经费;山西中医学院“2011”培育计划项目(No.2011PY－1)

△通讯作者Tel:0351－3179809;E－mail:macungen2001@163.com