脾虚证模型大鼠外观表征和神经功能态及不同健脾方作用的比较❋

张广霞，谢 鸣，刘碧原，张媛凤

(北京中医药大学方剂学学科，北京 100029)

脾虚证模型大鼠外观表征和神经功能态及不同健脾方作用的比较❋

张广霞，谢 鸣△，刘碧原，张媛凤

(北京中医药大学方剂学学科，北京 100029)

目的:比较中医补脾类方对脾虚证模型大鼠外观表征和神经功能状态的影响。方法:大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、补中益气汤组、四君子汤组、参苓白术散组，采用饮食失节+过度疲劳法复制脾虚模型。实验期间观察各组大鼠外观行为、体质量、体温变化和外周血相关指标。结果:较之于正常对照组，模型组大鼠出现外观行为异常，体质量、体温、血浆cAMP、Ach及cAMP/cGMP比值均降低，cGMP升高。较之于模型组，各给药组大鼠体质量、体温、cAMP及cAMP/cGMP升高，外观行为变化积分和cGMP降低，补中益气汤组和参苓白术散组Ach升高。三方组间比较，补中益气汤组体温和cAMP/cGMP均较其他两组升高，参苓白术散组Ach较其他两组升高。结论:补脾三方对脾虚证大鼠的脾虚症状、体温及植物性神经功能失调均有不同程度的改善作用，但对症状群的改善及对交感神经/副交感神经功能的调整各有侧重。

方证相关;脾虚证;健脾类方;外观行为;神经功能态

“方证相关”是中医辨证论治的重要命题之一，也是方剂学学理的逻辑基础［1］。方证相关是指中医辨证论治经验中方与证存在着不同程度的关联，即一个证常可以容许多个方剂治疗，而同一方剂也可用于多证的治疗，但获得最好疗效则应是与特定病证的病机具有高度关联的方剂。四君子汤、参苓白术散、补中益气汤是中医健脾的三首代表方，三方因药味组成不同，虽同有健脾功效，但在养胃和中、渗湿止泻、升阳退热方面各有偏颇;3方主治虽均涉脾虚证，但各方所主证的病机有所侧重。本文基于中医“方证相关”学理［1］，在观察脾虚证模型大鼠外观行为表征、体质量、体温及植物性神经功能态的基础上，试从同证异方的角度，比较观察四君子汤、参苓白术散、补中益气汤三方对该脾虚大鼠模型的相关作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验药物 人参、黄芪、白术、炙甘草、当归、柴胡、陈皮、升麻、茯苓、莲子肉、薏苡仁、砂仁、桔梗、白扁豆、山药共15味，均由北京同仁堂药业股份有限公司提供，并鉴定为正品，药物组成参考《方剂学》五版教材。四君子汤(人参10 g，白术9 g，茯苓9 g，炙甘草6 g)、补中益气汤(黄芪18 g，人参10 g，当归10 g，白术10 g，陈皮6 g，炙甘草5 g，柴胡3 g，升麻3 g)、参苓白术散(莲子肉6 g，薏苡仁6 g，砂仁3 g，桔梗3 g，白扁豆6 g，茯苓9 g，人参9 g，炙甘草5 g，白术9 g，山药9 g)，分别采用常规水煎提取方法制成颗粒，使用前以蒸馏水配置成浓度为100%的口服液。

1.1.2 动物 雄性SPF/AVFWistar大鼠210 g～220 g(动物许可证号SCXK(京)2012－0001)，由北京维通利华实验动物中心提供，适应性饲养7 d。

1.1.3 仪器 电子天平，北京北方首衡电子产品有限公司;塑料钢化桶，高60 cm，桶口径50 cm (执行标准为Q/WHC02－2002)，温岭大溪宏程塑料制品厂生产;数字温度计(MC－3B型)，OMROM欧姆龙(大连)有限公司生产。

1.2 方法

1.2.1 模型制作 大鼠适应性饲养7 d后进行预游泳，剔除游泳时间少于10 min、大于20 min的大鼠，采用饮食失节+游泳疲劳法［2］复制脾虚证大鼠模型，即合格大鼠每天2∶00 pm置于盛有温水(22±1℃)的塑料钢化桶中游泳10 min，隔日喂食(隔日禁食不禁水，隔日足量给食)，连续28 d。

1.2.2 分组与处理 合格大鼠按随机数字表法分为空白对照组(10～12只)和造模组(48只);造模组大鼠按上述方法造模2周后，按随机数字表法分为脾虚模型组、补中益气汤组、四君子汤组、参苓白术散组共4组，每组各12只。中药3组大鼠均按4.05 g/kg(相当于生药材含量，分别按处方人用量与大鼠体质量换算而成)分别给予补中益气汤、四君子汤、参苓白术散口服液灌胃，每日1次，连续14 d。于造模第29天腹腔注射10%水合氯醛(0.35 ml/100 g体质量)麻醉，腹主动脉取血6 ml于抗凝管中充分混匀，2000 rmp 10 min取血浆，测定Ach、cAMP和cGMP含量。

1.2.3 体质量和外观行为学评分 ①外观行为观测:记录各组每只大鼠的外观行为变化，每周记录2次(周三和周日)，按以下评分标准［3］。计算各行为指标的分值，取每周2次均值作为每周的行为变化分值;分别将行为状态与活跃程度、饮食状态与大便状态合并为活动状态1、饮食大便2、皮肤毛发为3，即3组症群，计算各组大鼠3组症群的积分及其总积分;②体质量和体温:每周二8∶00～8∶30称量大鼠体质量，8∶30～9∶30测量大鼠肛门温度。

表1 大鼠外观行为评分标准

1.2.4 外周血Ach、cAMP和cGMP含量测定血浆Ach、cAMP和cGMP含量按放免法测定。

1.2.5 统计学方法 采用 SPSS 20.0 FOR WINDOWS软件进行统计分析，各组数据均以均数±标准差(±s)表示，行单因素方差分析后，多组间比较采用Student Newman Keuls Test检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脾虚证模型大鼠外观行为变化及健脾三方的作用

表2、3显示，实验期间各时间段的空白对照组大鼠外观行为未见明显变化。造模2周后，脾虚模型组大鼠逐渐出现活动减少、扎堆甚至倦卧、大便稀溏、毛发枯乱、饮食减少等变化，计算各不同时间点的行为变化积分。与模型组比较，三方给药2周后，各组大鼠的行为均有不同程度改善，计算实验第4周时各组行为变化分值和总积分值。

表2 脾虚模型大鼠不同时间点各组症群分值变化比较(±s，n=10)

表2 脾虚模型大鼠不同时间点各组症群分值变化比较(±s，n=10)

注:与正常对照组同时间点比较:＊＊P＜0.01(1=活动状态，2=饮食大便，3=皮肤毛发)

组 别 症群 1周 2周 3周 4周0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.17±0.18正常对照组 2 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.25±0.07 3 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.20±0.08 1 0.25±0.00＊＊ 1.50±0.28＊＊ 2.00±0.00＊＊ 2.00±0.00＊＊脾虚模型组 2 0.25±0.00＊＊ 1.25±0.35＊＊ 2.00±0.00＊＊ 2.00±0.00＊＊3 0.125±0.00＊＊ 0.75±0.00＊＊ 1.65±0.00＊＊ 2.00±0.00 1＊＊

表2显示，实验期间正常组大鼠外观行为的积分变化不大。与正常组比较，脾虚模型组大鼠造模从第1周至第4周的外观行为积分值均见升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。

表3显示，与正常组比较，实验第4周模型组大鼠的活动状态、皮肤毛发、饮食大便、总积分分值均明显增加，差异均有统计学意义(P＜0.05);与模型组比较，健脾三方干预2周后，各组大鼠的活动状态、皮肤毛发、饮食大便及总积分分值均见下降，差异均有统计学意义(P＜0.05);三方组间比较，补中益气汤组大鼠的活动状态、皮肤毛发和总积分分值较其他两方降低，差异均有统计学意义(P＜0.05);参苓白术散组的饮食大便分值较其他两方组降低，总积分值较四君子汤组降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表3 各组大鼠第4周各症群分值变化(±s，n=10)

表3 各组大鼠第4周各症群分值变化(±s，n=10)

注:与正常组比较:＊＊P＜0.01;与脾虚模型组比较:▲▲P＜0.01;与补中益气汤组比较:●●P＜0.01，与四君子汤组比较:■■P＜0.01

组行为活动 皮肤毛发 饮食大便 总积分值正常对照组别0.31±0.08 0.28±0.10 0.31±0.07 0.90±0.16脾 虚 模 型 组 1.54±0.17＊＊ 1.61±0.15＊＊ 1.73±0.23＊＊ 4.88±0.30＊＊补中益气汤组 0.74±0.04▲▲ 0.74±0.04▲▲ 0.87±0.06▲▲ 2.36±1.36▲▲四 君 子 汤 组 1.18±0.07▲▲●● 1.25±0.14▲▲●● 0.87±0.08▲▲ 3.31±0.25▲▲●●参苓白术散组 1.17±0.07▲▲●● 1.24±0.15▲▲●● 0.68±0.07▲▲●●■■ 3.01±0.25▲▲●●

2.2 脾虚证模型大鼠体质量和体温变化及健脾三方的作用

表4、5显示，实验期间正常组大鼠体质量逐渐增加、体温变化不大。与正常组比较，脾虚模型组和三方各组(未给药前)大鼠造模第1周和第2周后的体质量和体温均见降低，差异均有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，给药1周和2周后，三方各组大鼠的体质量、给药1周后补中益气汤组体温、给药2周后3方各组大鼠体温均见不同程度增加，差异均有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)。三方组间比较，给药1周和2周后各组大鼠体质量差异均无统计学意义(P＞0.05);补中益气汤组大鼠的体温较其他两方组增加，差异均有统计学意义(P＜0.01)。

表4 不同时间点各组大鼠体质量变化比较(±s，g)

表4 不同时间点各组大鼠体质量变化比较(±s，g)

注:与正常对照组同时间点比较:＊＊P＜0.01;与脾虚模型组同时间点比较:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

组别 例数 1周 2周 3周 4周正常对照组 10 337.0±16.71 386.3±23.77 411.2±24.53 436.1±27.96脾虚模型组 10 290.3±10.34＊＊ 309.4± 6.49＊＊ 318.0±17.83＊＊ 325.3±14.06＊＊补中益气汤组 10 290.9±15.81＊＊ 309.3±14.63＊＊ 345.5±19.79▲ 366.1±20.76▲▲四君子汤组 10 291.7±10.83＊＊ 307.7±13.31＊＊ 341.5±16.35▲ 355.7±15.90▲▲参苓白术散组 10 291.5± 9.73＊＊ 309.7±12.86＊＊ 346.2±23.36▲ 360.8±23.30▲▲

表5 不同时间点各组大鼠体温(T)变化比较(±s，℃)

表5 不同时间点各组大鼠体温(T)变化比较(±s，℃)

注:与正常对照组同时间点比较:＊＊P＜0.01;与脾虚模型组同时间点比较:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01;与补中益气汤组同时间点比较:●●P＜0.01

组别 例数 1周 2周 3周 4周正常对照组 10 37.15±0.51 37.23±0.33 37.14±0.23 37.49±0.27脾虚模型组 10 36.39±0.18＊＊ 36.20±0.13＊＊ 36.06±0.23＊＊ 35.65±0.66＊＊补中益气汤组 10 36.46±0.18＊＊ 36.28±0.11＊＊ 36.49±0.14▲▲ 36.75±0.19▲▲四君子汤组 10 36.43±0.15＊＊ 36.18±0.10＊＊ 36.16±0.34 36.03±0.17▲●●参苓白术散组 10 36.45±0.21＊＊ 36.27±0.15＊＊ 36.16±0.22 36.04±0.17▲●●

2.3 各组大鼠血中Ach、cAMP、cGMP的变化及健脾三方的作用

表6显示，与正常组比较脾虚模型组大鼠血中Ach降低，差异有统计学意义(P＜0.01);cAMP和cGMP分别降低和升高，cAMP/cGMP比值降低，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。与模型组比较，三方各组大鼠血中Ach均有不同程度降低，其中补中益气汤和参苓白术散升高显著，差异有统计学意义(P＜0.05或 P＜0.01);cAMP和cGMP分别呈升高和降低，cAMP/cGMP比值升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。三方组间比较，参苓白术散组Ach较其他两方均升高;补中益气汤组血中cAMP和cGMP较其他两方组呈升高和降低，cAMP/cGMP比值升高，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);四君子汤组cAMP/cGMP比值较参苓白术散组升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

本学科曾根据中医“饥饱失常、肠胃乃伤”和“劳则伤脾”的中医发病学理论，采用饮食失节+过度疲劳法复制出大鼠脾虚证模型，并观察到该模型大鼠出现类中医脾虚证的外观行为变化［3－5］。本研究对大鼠外观行为观察指标进一步进行了分值确定和归类处理，以提高其结果的准确性。实验观察到，脾虚模型大鼠于实验第2周即出现活动减少、喜扎堆、食少便溏、皮毛不顺等变化，随时间的延长各组指标的积分不断增加，至第4周变化总积分明显增加，且出现明显的动作迟缓、倦卧、毛发不泽、饮食减少、大便稀溏、形体消瘦、体质量明显降低等类中医脾虚之象。

表6 各组大鼠血浆Ach、cAMP、cGMP及比值变化比较(±s，n=10)

表6 各组大鼠血浆Ach、cAMP、cGMP及比值变化比较(±s，n=10)

注:与正常对照组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与脾虚模型组比较:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01;与补中益气汤组比较:●P＜0.05，●●P＜0.01;与四君子汤组比较:■P＜0.05，■■P＜0.01

组别Ach(ug/ml) cAMP(nmol/l) cGMP(nmol/l)cAMP/cGMP正 常 对 照 组 881.17± 75.47 33.42±1.72 8.70±0.76 3.86±0.23脾 虚 模 型 组 563.19± 29.10＊＊ 30.80±2.02* 9.54±0.16* 3.25±0.27＊＊补中益气汤组 635.57± 59.21▲ 39.79±1.74▲▲ 6.26±0.60▲▲ 6.38±0.37▲▲四 君 子 汤 组 596.44± 13.77 35.75±1.96▲▲●● 6.77±0.88▲▲ 5.33±0.50▲▲●●参苓白术散组 947.83±116.71▲▲●●■■ 36.99±3.87▲▲● 7.44±0.63▲▲●● 4.97±0.16▲▲●●■

植物性神经又称自主神经，在调节内脏器官的功能及维持机体内外环境的平衡中发挥着重要作用。乙酰胆碱是副交感神经的重要递质，血浆cAMP、cGMP也常被作为交感功能活性的敏感指标［6］。当体内cAMP、cGMP及比例失衡时，植物神经功能出现紊乱［7］，而体温的上升和下降也与交感神经和副交感神经兴奋状态有关［8］。临床曾观察到，脾虚证患者伴有植物神经功能紊乱，其交感神经兴奋性降低，副交感神经兴奋性偏亢［9－10］;实验也观察到，用大黄水煎液灌胃7 d后复制出的脾虚证大鼠血浆中cAMP和cAMP/cGMP比值降低，cGMP升高［11－12］，提示中医脾虚证与植物性神经功能异常有关。本实验也观察到，采用饮食失节和游泳疲劳的方法造模4周的脾虚证大鼠，在出现类似脾虚外观行为表征的同时，血中cAMP含量降低，cGMP含量升高，cAMP/cGMP比值降低，且Ach降低，表明该模型存在植物性神经功能异常，即交感神经功能低下和副交感神经功能偏亢，影响其消化吸收功能，故出现食欲减退、体质量与体温减低、皮毛不泽、扎堆少动及便溏泄泻等变化。

四君子汤是健脾益气的基本方，参苓白术散和补中益气汤均由其加味变化而成。三方同有益气健脾之功，但参苓白术散兼能和胃渗湿，补中益气汤尤能升阳举陷。从具体配伍用药来看，三方中以补中益气汤健脾益气作用最强，参苓白术散居中，四君子汤次之。

本实验观察到，补脾三方作用于脾虚证模型大鼠2周后，各组的外观行为、体质量、体温及反映植物性神经功能的指标均有不同程度改善，表明三方均有一定改善脾虚症状和调整植物性神经功能的作用。但三方的作用各有不同，如四君子汤对外观行为诸证有一定的改善，但对脾虚大鼠血中Ach无明显影响;参苓白术散对外观表现中食少和便溏的改善作用更为明显，且对血中Ach的作用明显优于四君子汤和补中益气汤;补中益气汤对外观表现中活动减少和毛发不荣有更好的改善作用，且对体温和血中cAMP的作用明显优于四君子汤和参苓白术散，表明三方在改善脾虚证相关指标或病理环节上各有侧重，同时也提示参苓白术散和胃渗湿与调节迷走神经、补中益气汤升阳举陷与调节交感神经的功能更为密切。从三方对脾虚指标的综合作用来看，补中益气汤的作用更为广泛和明显，参苓白术散则次之，四君子汤较弱，此与三方用药配伍及健脾益气功用强度有所不同的经验认识相一致。

综上所述，四君子汤、参苓白术散、补中益气汤对脾虚模型大鼠的脾虚症状均有不同程度改善作用，但对脾虚证候中不同症群的作用有一定的侧重;三方对脾虚大鼠失调的植物性神经功能状态均有不同程度的调整作用，但对交感神经和副交感神经功能的作用则各有偏颇，本研究为中医类方配伍及其功效的同异理解提供了一定的现代药理学依据。

［1］谢鸣.“方证相关”逻辑命题及其意义［J］.北京中医药大学学报，2003，26(2):11.

［2］王洪海，谢鸣.复合因素致脾虚证模型大鼠血中胃肠激素含量的变化［J］.中国实验方剂学杂志，2006，12(10):31－35.

［3］李聪，谢鸣，赵荣华.舒肝健脾方对肝郁－脾虚－肝郁脾虚证大鼠外观表征的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2013，19 (11):1279－1281.

［4］王洪海，谢鸣.复合病因造模法致脾虚证大鼠模型在免疫系统方面的变化［J］.中国实验方剂学杂志，2006，12(12):41－44.

［5］刘进娜，谢鸣，高秀兰，等.脾虚发热证大鼠模型的研究［J］.中国中医基础理论杂志，2012，18(2):150－153.

［6］林立，综述，万林，等.振动植物性神经功能紊乱评价指标及其临床意义的研究［J］.中国行为医学科学，1997，6(1):77－79.

［7］支红波，王树德，鲍修敏.偏头疼患者血浆内皮素与环核苷酸水平变化研究［J］.滨州医学院学报，2001，2(24):114－117.

［8］高明灿.生理学［M］.北京:高等教育出版社，2006:141.

［9］尹光耀，周溪中，唐静芬，等.脾虚证慢性患者胃黏膜与血浆cAM P和cGMP测定及其临床意义［J］.中西医结合杂志，1985，5(1):30.

［10］魏睦新，贝淑英.脾阴虚证植物神经功能状态初探［J］.中西医结合杂志，1988，8(4):202.

［11］魏彦明，翟自明，郑继方，等.脾虚证模型家兔神经内分泌机能的变化及四君子汤对其调整作用［J］.中国兽医学报，1999，19(5):487－489.

［12］尹桂山，王桂香，李恩，等.益气健脾汤对大鼠血浆、脾脏环核苷酸及其酶系的调整作用［J］.中国中西医结合杂志，1990，10(11):672－674.

Comparison of the Appearance and function of Nervous Function and the Effect of Different Kinds of Invigorating Spleen Prescription in Rats with Spleen Deficiency Syndrome Model

ZHANG Guang－xia，XIE Ming△，LIU Bi－yuan，ZHANG Yuan－feng
(Formulary Department，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China)

Objective:To compare the effects of different reinforcing spleen recipes on the appearance representations and nerve function in rats with spleen－deficiency syndrome.Method:The male wistar rats were randomly assigned into the normal group(group 1)，the spleen－deficiency group，Buzhong Yiqi Decoction group(group 3)，Si Junzi Decoction group (group 4)，Shenling Baizhu Powder group(group 5).Rats of group 3，4 and 5 had been respectively fed with medicine of Buzhong Yiqi Decoction，Si Junzi Decoction，Shenling Baizhu Powder 4.05 g·kg－1for two weeks.The ones of the group 1 and 2 were fed with equivalent physiological saline for two weeks.All the changes in behavior，body weight and temperature were observed and recorded.On the 29thday，all rats of plasma levels of 3’，5’－cyclic adenosine monophosphate (cAMP)，3’－5’－cyclic guanosine monophosphate(cGMP)and achtylcholine(Ach)were detected.Result:Compared with normal group，the model rats shown the abnormal of behavior and the weight，body temperature，plasma cAMP，Ach and cAMP/cGMP decreased significantly，cGMP increased significantly.Compared with model group，The weight，body temperature，cAMP and cAMP/cGMP of the three medicated groups all increased significantly，the behavior of integral value and cGMP decreased significantly.Plasma Ach increased significantly in group 3 and 5.Compared with group 4 and 5，the temperature，cAMP and cAMP/cGMP increased significantly in group 3，compared with group 3 and 4，the Ach increased significantly in group 5.Conclusion:Three different reinforcing spleen recipes on the spleen－deficiency symptoms，temperature and vegetative nerve function of rats model with spleen－deficiency syndrome had marked improvement，however，to improve different types of schizophrenia，sympathetic and parasympathetic nervous systems function had particular focuses respectively.

Relativity between formula and syndrome;Spleen－deficiency syndrome;Reinforcing spleen recipes; Appearance representations;Nerve Function

R285.5

:B

:1006－3250(2015)12－1503－04

2015－03－18

国家自然科学基金资助项目(81173193)

张广霞(1987－)，女，内蒙古赤峰人，医学硕士，从事方证相关及复方物质基础的研究。

△通讯作者:谢 鸣，男，安徽安庆人，教授，Tel:010－64286992，E－mail:xieming603@263.net。