丙酮—丁醇的微生物发酵生产

朱会芹　王瑞飞

摘 要：在过去的一段历史时期内，丙酮-丁醇发酵一度因生产成本高，产率低而发展迟缓。近年来，随着能源需求的改变及环境保护的要求，其可再生、无污染的优点再次引起人们的关注。该文对丙酮-丁醇发酵过程中所需的可替代性原料、高产菌株选育技术及相关发酵工艺等方面的最新进展进行了总结，并对这些方面进行了简单评述。

关键词：生物燃料 微生物发酵 可替代性原料 菌株选育 发酵工艺

中图分类号：Q93 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2015）12（a）-0120-03

丙酮-丁醇发酵历史悠久，早在1912年，人们开始利用梭状芽孢杆菌发酵，即以粮食作物为原料生产丙酮和丁醇[1]。该产业一度成为世界上第二大发酵产业，用于生产火药、合成橡胶等重要的化学品。直到20世纪中叶，廉价的石油被大量开采和利用，以石油为原料来合成化工产品的方法快速兴起，导致丙酮-丁醇发酵方法的利用越来越少，其发酵工艺的改进也严重迟滞。进入21世纪后，由于人类长时间的开采，石化资源已接近耗竭；另外，由于工艺水平和处理技术的限制，大量含有石油类的废渣、废水排放引起了严重的环境污染。为了贯彻经济与生态环境协调发展的方针政策，寻找绿色能源已经成为迫在眉睫之事。此时，丙酮-丁醇发酵途径再次引起人们的极大关注，微生物发酵制丙酮-丁醇较原来丙酮-丁醇发酵的优点是发酵周期短、产物转化率高、代谢副产物少。因此即使目前微生物发酵产丙酮-丁醇成本高，尚不具有很大的竞争市场，但是通过原料和技术的改进后可以降低生产成本、增加产量，丁醇将成为最具实用价值的廉价、清洁的新型液态生物燃料。该文章对近年来改善丙酮-丁醇发酵的相关方法和措施进行综述，以期对相关领域的研究人员有所帮助。

1 生产丙酮-丁醇的可替代性原料

目前，工业生产丙酮和丁醇主要以农作物为原料，存在着成本高，产量相对较低的问题。为了解决这种问题，需要寻找可替代原料。近年来发现的可替代原料主要有木质纤维素类、合成气、废弃蛋白质类。目前认为，木质纤维素类生物质是世界上最丰富、最廉价的可再生能源，木质纤维素类包括森林残留物和农业残留物，都可用acetone-butanol-ethanol（ABE）梭状芽孢杆菌发酵生产丙酮和丁醇，但是对于不同的木质纤维素类原料，丙酮-丁醇的生产效率也不尽相同。Swana等[2]用4种原料：柳枝稷、杨树、玉米秸秆、小麦秸秆生产丁醇时发现，玉米秸秆是生产丁醇产量最高的原料，其在生产丙酮和丁醇过程中最大利用率可达75%。依据当前情况看，玉米秸秆仍是纤维素类物质中用于生产丙酮和丁醇的首要选择。合成气是由CO、H2、CO2等组成的混合气体，合成气发酵燃料是一种商业化的边缘技术，其低成本的发酵媒介提高了发酵过程的可行性。例如，使用玉米浆（CSL）代替酵母提取物，发酵介质成本减少了27%，乙醇的产量较原来多出78%。CSL介质用于连续发酵时，产生乙醇、正丙醇、正丁醇的最大浓度分别是8 g·L-1、6 g·L-1、1 g·L-1[3]。随着人们生活水平的提升，动物垃圾和粪便越来越多，其中富含丰富的蛋白质，回收利用废弃蛋白质用于生物燃料生产不仅有利于改善环境也扩大了能源来源。但是，微生物很少利用废弃蛋白来制得生物燃料，这就需要对现有菌株进行改造。Choia等利用抑制B. subtilis的支链氨基酸代谢途径以及敲除脂肪酰转移酶的手段，发酵生产更多的丁醇、异丁醇等生物燃料。利用木质纤维素类、合成气、废弃蛋白质类可替代性废弃原料生产丙酮-丁醇，仍然是相对不成熟的技术，需要继续研究探讨其商业化的可行性。

2 丙酮-丁醇高产菌株选育

丙酮-丁醇高产菌株选育是通过改良菌种以及改进现有的发酵工艺来提高其产量的过程。改良菌种可以利用诱变育种、代谢工程改造和基因重组技术来实现，其中，诱变育种技术需要外界环境对菌种产生干扰，如等离子体干扰等，进而改变微生物的遗传性状增加丙酮-丁醇转化率，这种育种方法操作简便、速度快、收效大，也是目前菌种选育的主要方法。例如，Li等在大气和室温等离子体环境下培养acetobutylicum梭状芽胞杆菌PW12，获得其突变菌株ART18，生产丁醇为（11.3±0.5） g·L-1，比原来野生型菌株高出31%。代谢工程改造通过基因表达、敲除基因等手段改进细胞代谢特性。例如，Hou等使C.acetobutylicum菌株的adc基因失活消除丙酮生产，同时把与谷胱甘肽生物合成能力有关的大肠杆菌的adc gshAB基因导入c acetobutylicum菌株，以增强其健壮性。在此过程中，丁醇生产从（5.17±0.26） g·L-1提高到（8.27±0.27） g·L-1。基因敲除是改变某些基因序列，导致相关基因功能丧失，进一步对生物体遗传性状造成影响的技术。该技术在丙酮-丁醇高产菌株选育中也有应用，Xu等发现梭状芽胞杆菌突变珠acetobutylicum JB200的单一碱基缺失导致Cterminal cac3319基因不能编码组氨酸激酶，致使丁醇产量（18.2±1.3和12.6±0.2 g·L-1）比野生型的菌株高出44.4%。基因重组是指在生物体产生后代的过程中，控制不同性状的基因重新组合，Gao等利用Clostridium acetobutylicumCICC 8012菌株，通过基因重组获得高产菌株 F2-GA，其发酵72 h后丁醇/丙酮/乙醇总溶剂的产量达到了22.21 g·L-1，与原始菌株比，丁醇产量提高了34.53%。丙酮-丁醇高产菌株选育改变了原有菌株的结构，使菌株的遗传性状发生改变，大大提高了丙酮-丁醇的产量。在以后的研究中，人们所面临的巨大挑战是，如何进一步将这些菌株进行改造，使其能够在工业生产中大规模使用。

3 改进丙酮-丁醇发酵工艺

为了更好地发展丙酮-丁醇工艺，可以对发酵条件进行优化，或者增加对发酵过程中辅因子的调节。

3.1 发酵条件优化

对于不同的菌株所需培养的外界条件不同，为了使菌株产量达到最大化，必须寻找最佳培养条件，使高产基因有效表达。培养条件的影响因素包括多种，如最适pH和比较完善的培养系统等，都能影响丙酮-丁醇产量，Jiang等发现pH是梭状芽胞杆菌生产丙酮、丁醇、乙醇过程中的一个重要影响因素。在这项研究中，梭状芽胞杆菌beijerinckii IB4在不同pH值从4.9到6.0下进行分批发酵，在pH值为5.5时，ABE产量逐渐占优势，其最大浓度达到24.6 g·L-1 （15.7 g·Lof-1丁醇、8.63 g·L-1的丙酮和0.32 g·L-1的乙醇），此过程历经36 h消费60 g·L-1葡萄糖。与pH不受控制的情况相比，丙酮-丁醇产量大大提高。除了培养条件之外，培养系统也能影响丁醇生产效率。Wang等开发出一种培养系统，该系统利用不同微生物的特定代谢能力直接产生丁醇。该研究主要目的在于寻找互补的微生物进行丁醇生产，结果发现，新的微生物团体N3和菌株c celevecrescens N3-2能有效降解纤维素和产生大量的丁醇。由此可知，通过改变发酵过程的培养条件，营造适宜的转化环境，可以从很大程度上推动丁醇的发酵效率增加。

3.2 梭菌辅因子扰动

丙酮-丁醇发酵过程中存在许多辅因子，它们有的能够促进丁醇生产，有的却对丁醇产生很大干扰，这些辅因子（包括ATP/ADP，NADH/NAD+等）在微生物代谢系统中广泛存在。它们在发酵过程中几乎为全部生化反应提供能量、还原力，所以具有掌控全局的效应。正因为如此，丙酮-丁醇梭菌辅因子的研究意义十分重大。ATP主要参与底物水平磷酸化和氧化磷酸化，是在线粒体中完成ATP合成，可以通过调节电子传递链以及氧气供给量来影响ATP，进而影响丁醇产量。因此，利用一系列酶的作用，对电子传递链的活性进行调控，可以影响ATP合成。Kuit等改变C.acetobutylicum菌株基因结构，减少醋酸酶激酶，抑制磷酸乙酰乙酸去磷酸化促使ADP生成ATP，致使C. acetobutylicum菌株增加乙醇（63%）、丁醇（16%）产量并减少乳酸（50%）的产生。另外，NADH/NAD+氧化还原力调控在调节微生物代谢方面起着至关重要的作用，它一般分为外源生化过程和内源基因工程手段对氧化还原力进行调控。例如，Yang等利用外源调节发酵过程中的还原力，通过人工控制溶解氧和酶物质，效价提高到102.3 g·L-1，收益率是0.44 g·g-1，以及丁醇生产力达到1.16 g·L-1·h-1。Li等通过内源调节把烟酸（NADH和NADPH的前体）加入野生型梭状芽孢杆菌的生长介质中，细胞生长速率和丁醇生成速率大大增加。控制胞内能量和还原力供应能有效地改变微生物发酵过程中的代谢途径，也可以促进微生物最大化地合成目标产物，增加代谢速率，提高微生物发酵的经济性和竞争力。

4 结语

生物丁醇较乙醇是一种更好的可再生燃料，很可能代替汽油再次成为一种重要的化工原料。当前迫切需要解决的问题是提高生物发酵丁醇产量及进一步降低其生产成本。根据目前已有报道，可以从以下方面增加丁醇产量：丁醇在商业化的进程中对原料选择很苛刻，农作物作为丁醇原料已不能满足当前的市场需求，因此，农业废弃物（木质纤维原料）和便宜的工业废弃物在未来将会被大规模利用；目前应用的梭状芽孢杆菌生产的丁醇产量较低，急需选育高产菌株和提高菌株利用率；丙酮-丁醇发酵工艺可以大大加速发酵进程，通过优化发酵条件，实施梭菌辅因子扰动，可以降低成本，增加丁醇产量。目前，我国对生物丁醇的研究也逐渐增加，国家许多项目如“973”“863”计划等都涉及了丁醇生产。随着国家的投入力度增大，丁醇技术也越来越成熟，我国丁醇发展前景将十分广阔。

参考文献

[1] Green EM. Fermentative production of butanol—the industrial perspective[J]. Current Opinion in Biotechnology，2011，22（3）：337-343.

[2] Swana J，Yang Y， Behnam M，etal.An analysis of net energy production and feedstock availability for biobutanol and bioethanol[J]. Bioresource Technology ，2011，102（2）：2112-2117.

[3] Liu K， Atiyeh H K， Stevenson B S，etal.Continuous syngas fermentation for the production of ethanol，n-propanol and n-butanol[J]. Bioresource Technology，2014（151）：69-77.